超声辅助提取耳叶番泻总酚的工艺研究及其抗氧化活性评价

原文作者 G. Sharmilaa,lowast;, V.S. Nikithaa, S. Ilaiyarasi a, K. Dhivyaa, V.Rajasekar a, N.Manoj Kumar b,

K. Muthukumaranc, C. Muthukumarana

单位 a政府科技大学工业生物技术系，印度哥印拜陀641 013

b SRM大学生物工程学院基因工程系，印度Kattankulathur 603203 c政府科技大学化学系，哥印拜陀641013

摘要：

本研究对超声波辅助提取多酚的工艺条件进行了优化。

本实验采用响应面分析法（RSM），将三级四因子箱 Behnken设计（BBD）用于研究超声辅助提取（UAE）工艺中的最佳提取参数：提取时间（5,10,15min）、pH值（5,6,7）、溶剂浓度（40,50,60%）和超声波。本实验对采自阿联酋的耳叶番泻的总酚含量进行了测定，以TPC（总酚含量），FRAP（铁还原性抗氧化能力）和DPPH（1，1，0，2，2，2，5-吡啶酰肼基）自由基清除活动作为回应，利用回归分析得到的系数，建立了TPC、FRAP和DPPH的二阶多项式模型。ANOVA分析显示，pH对TPC、DPPH和FRAP的抗氧化活性均有显著影响。在最佳条件即萃取时间5min、pH值6.2、溶剂浓度60%、功率50W时，TPC、FRAP和DPPH的活性分别为59.68（mgGAE/g）、96.2（mM Fe2 /g）和90.5%。验证实验结果与响应面法的预测结果较吻合。本研究表明，UAE是提取耳叶番泻叶总多酚的较好方法，而多酚具有良好的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂应用于制药和食品工业。

关键词：抗氧化活性；耳叶番泻；最佳化；响应曲面法；总酚类；超声辅助萃取

1、介绍

一些疾病，如癌症、关节炎、帕金森病和心脏病都是由氧化应激作用引起的，而这些氧化应激作用则是由氧和氮（超氧化物、过氧化氢和羟基自由基）引起的(Tabaraki and Nateghi, 2011)。这些物质通过接触污染物和细胞代谢，导致蛋白质氧化，引起低密度脂蛋白DNA、细胞损伤和包装食品营养价值的丧失而产生。生物机体的防御机制主要是通过抗氧化剂中和活性氧，这些活性氧主要是由人类和植物体内的莽草酸和褪黑酸途径产生的酚类化合物等次生代谢产物。对老年人而言，将合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚（BHA）、丁基羟基甲苯（BHT）、叔丁基对苯二酚（TBHQ）和没食子酸丙酯（PG）添加进药物、保健品和化妆品的方法被认为是不安全的。因此研究人员不断研究新的天然抗氧化剂（黄酮、类胡萝卜素、维生素C和多酚），发现这些天然抗氧化剂作为食物补充剂可降低疾病风险。

植物产生的酚类化合物具有不同的极性和理化性质，但对人却具有良好的药理活性。Asian（决明属）是一种生长迅速的灌木，在印度广泛分布，属于云实科，能在恶劣条件下生存(Jaydeokar et al., 2014)。它在泰米尔语中通常被称为阿瓦兰树，在英语中被称为坦纳肉桂 (Vijayaraj et al., 2013)。在印度，从很早开始，耳叶番泻就被用作民间和阿育吠陀来降低血糖水平，治疗糖尿病(Latha and Pari, 2003)。它的叶是互生的，紧密地有16-24片叶，是个大的亮黄色的花和短的豆科果，在它的洞中有12-20粒种子(Nanjaraj Urs et al., 2015; Joy et al., 2012)。据报道，一些植物化学成分如黄酮、多糖、蒽衍生物、生物碱和单宁具有治疗糖尿病、血脂异常、结膜炎、肾脏和肝脏疾病、溃疡、哮喘、皮肤病和癌症的作用(Juan-Badaturuge et al., 2011)。（木耳的）丙酮水提物中含有苯并香豆素苷、阿魏酸苷Ⅰ、阿魏酸Ⅰ，对肝功能紊乱有保护作用(Nakamura et al., 2014)。其他成分包括木犀草素、山奈酚、槲皮素、杨梅素、3-甲氧基葡萄糖苷、山奈酚3-O-d-吡喃葡萄糖苷、表没食子素和大黄素，它们含有羟基、酯、芳香环和乙醚功能，具有解热、抗溃疡、抗蠕虫和保护肝脏的作用。

植物源酚类化合物的提取方法有多种。传统的萃取方法是将热处理后的水提液回流，采用索氏法，但由于氧化、水解、升温和延长了萃取时间，使萃取率降低。为了克服传统提取方法的缺点，找到了一种合适的提取方法，命名为“绿色提取法”，它更快，占用更少的工作空间，增加热量和传质，消耗更少的能量，可以在有限的溶剂和原料下加工，可使用替代溶剂萃取和非专用设备，能够以较少的单位操作生产出更多的无毒、不变性的产品。无溶剂萃取或绿色萃取工具可用于压制、微波、超声波、超临界流体萃取和瞬时控制压降(DIC)等操作(Chemat et al., 2015, 2012; Rombaut et al., 2014)。因此，选择对酚类化合物影响较小的提取方法至关重要。超声波辅助提取技术（UAE）已被应用于营养品、抗生素、多酚、氟哌醇和多糖的提取(Azmir et al., 2013; Lianfu and Zelong, 2008; Chen et al., 2007; Liao et al., 2015)。UAE通过剪切力破坏植物细胞壁，利用超声波（20-100Khz）的压缩和膨胀产生的空化作用造成有效的混合和扩散速率。超声提取过程具有扩散、传质、细胞最大破壁、声光效应和溶剂渗透等特性。而且，超声在溶胀指数和萃取值方面都具有优势，在任何类型的萃取中都能定量验证萃取剂的质量 (Mason et al., 2011).。大量研究表明，超声波辅助提取法具有许多优点，在提取过程中得到了广泛的应用。但超声波处理会导致超声波处理后抗氧化性的下降(Pingret et al., 2013)。然而，优化实验参数，如使用混合溶剂、调整时间、功率、超声波频率等，可以降低降解程度(Eh and Teoh, 2012)。 优化研究不仅提高了产品的质量，还提高了产品的产量，为了实现UAE的大规模商业化，需要在实验室规模内对波分布频率、功率、溶剂种类、压力、温度和时间等因素进行研究(Yingngam et al., 2014; Wu et al., 2014)。

一次一个因素的优化，是一种耗费时间的方法，它无法解释所研究的因素之间的相互作用效应。响应面方法（RSM）是一种统计方法，用于分析和预测设计空间内选定变量的最优水平，并在较少的实验和时间内确定变量之间的相互作用效应(Myers and Montgomery, 1995). 该技术被广泛应用于生物化学和其他行业的工艺参数优化(Wu et al., 2015; Sharmila et al., 2013).。本研究的目的是优化UAE工艺变量，以获得最大量和具有高抗氧化能力的总酚。利用响应面法的盒-贝恩肯设计（BBD）对萃取时间（A）、酸碱度（B）、溶剂浓度（C）和超声波功率（D）等工艺参数进行了优化和研究。

2.1. 化学品和试剂

化学药品,DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼),TPTZ（2,4,6-三吡啶-硫-三嗪），碳酸钠、没食子酸、氯化铁、硫酸亚铁、醋酸钠、冰醋酸、盐酸、甲醇、乙醇、福林-西卡托试剂（由喜美达化工有限公司采购）。本研究中使用的所有化学品均为分析级。

2.2. 收集植物材料

采自泰米尔纳德邦科印拜托雷地区的耳叶番泻新鲜叶片，用蒸馏水洗涤。新鲜的叶子被晒干一个星期，然后磨成粉末。粉末样品用塑料袋包装，抽空，密封，防光，在室温下储存，等待用于进一步的研究。

2.3超声波辅助提取酚类化合物

采用超声波辅助处理的方法从耳叶番泻叶中提取酚类化合物。

添加1克的叶子粉末和25毫升的溶剂于烧杯。将烧杯置于超声波发生器中，30W超声波作用30min，提取酚类化合物。按照表1中给出的实验设计进行响应面法优化研究。

2.4总酚含量的测定(TPC)

用1号滤纸经超声波处理后，在4000rpm离心15min，收集上清液。用福林-西卡胶纸片法测定上清中的总酚含量(Liu et al，2013）。2.5毫升稀释10倍福林-在上清液中加入0.5 mL钙试剂和2ml的碳酸钠水溶液（75g/L）。混合物在50℃的水浴5分钟，然后在室温下冷却。吸光度用紫外可见分光光度计在760nm处测量。总酚含量按没食子酸标准溶液的校正曲线计算。

总酚收率百分比计算如下：

总酚含量（mgGAE/g） = 浸提酚重量（毫克） /叶粉重量（克）(1)

2.5. 抗氧化测定

采用DPPH法和铁还原抗氧化能力（FRAP）法研究耳叶番泻提取物的抗氧化能力。(Ivanovic et al., 2014).

2.5.1. DPPH 测定

萃取物100℃与3ml甲醇和含DPPH（2,2-二苯基-1-苦味酰肼）自由基（0.012 g/100 mL）的1ml甲醇溶液混合。在室温下，将反应混合物混合并放置120分钟，在517nm处对空白处读吸光度值。用下面的公式计算清除能力：

清除能力(%) = A517对照 minus; A517样品 x100/A517对照

2.5.2. 铁还原抗氧化能力(FRAP)测定

为了制备FRAP试剂，在容量瓶（1L）中稀释含有6.4mL 2M乙酸钠溶液和93.6mL 2M乙酸溶液的300mmol/L乙酸钠缓冲液pH3.6，10mmol/LTPTZ和20mmol/LHCI制备成40mmol/L四氯化铁(10:1，v/v/v)。甲醇植物提取物（25℃）与4.5 mL的FRAP试剂混合。在FRAP方法中，黄色的Fe3 TPTZ络合物在酸性条件下被供电子体还原成蓝色的Fe2 -TPTZ络合物。用紫外可见分光光度计在593纳米处测量5分钟后的吸光度读数。空白的是FRAP试剂。每个样品的吸光度与硫酸亚铁（Feso4·7H2O）（0.2-2 mM/L）的标准曲线进行比较。所得结果以提取物mM Fe2 /g表达。FRAP的标准曲线方程是Y=0.029x 0.005.所有的实验都是一式三份，并对结果进行了平均。

2.6阿联酋响应面优化

利用响应面法优化了超声辅助提取耳叶番泻叶总酚类物质的工艺参数。本研究采用Design Expert软件进行统计优化与分析。选择4个变量，萃取时间（A），pH（B），溶剂浓度（C）和超声功率（D）进行响应面法优化研究。Box–Behnken设计（BBD）的遥感模型用以确定最佳水平和变量对反应的影响。在提取时间（15、10、5分钟）、pH（7、6、5）、溶剂浓度（60、50、40%）和超声功率（50、40、30）三个水平（高、中、低）对所选变量进行了研究。根据BBD进行了29项实验，并将反应（TPC、DPPH清除活性和FRAP）列表列于表1。用二阶多项式方程解释了因变量和自变量之间的关系。(3)

其中Y是预测响应；lt;unkgt; 0是模型截距；alpha;i和Aj是自变量；lt;unkgt; i、lt;unkgt; ii和lt;unkgt; ij分别是线性、平方和相互作用效应的回归系数。N表示本研究中的自变量数和（N=4）。多项式模型方程的部分质量由测定系数（R2）表示(Badwaik et al., 2012).

3结果和讨论

3.1.溶剂筛选

植物总酚的提取效率受提取溶剂类型的影响很大(Liyana-Pathirana and Shahidi, 2005)。为了获得最大的总酚萃取率，在30W的条件下，对乙醇（80%）、甲醇（80%）和水3种溶剂作为实验试剂进行了超声波辅助萃取30min的比较研究。图1表明甲醇对酚类物质的萃取效率最高（70.1mgGAE/g），其次是乙醇（56.8mgGAE/g）和水（29mgGAE/g），因此选择甲醇作为萃取溶剂进行进一步实验。甲醇是溶剂萃取抗氧化剂的常用溶剂，与其它有机溶剂相比，甲醇具有较高的极性指数5.1，介电常数33，沸点68℃，因此高介电常数的溶剂可提高萃取率，且68℃的沸点适中不会使产品变性。汉森溶解度参数根据分散力、氢键和分子间力的能量来预测一种材料在另一种材料中的溶解度。 (Stefanis and Panayiotou, 2008). 结果表明，甲醇的汉森溶解度参数为29.6，摩尔体积为40.7，可作为提取植物源中抗氧化化合物的有效溶剂。几位作者报告说，甲醇是提取植物酚类物质的最佳溶剂 (Ye et al., 2015; Vajic et al., 2015; Nabyla et al., 2014)，甲醇还通过抑制植物提取物中的多酚氧化酶活性来降低酚类变性(Tura and Robards, 2002)。

3.2. UAE优化的响应面

3.2.1. 实验设计

采用BBD实验设计，研究了超声波辅助提取耳叶番泻中酚类物质的方法。在三个层面上研究了四个变量，实验设计在表1中给出。进行了29次实验，并对相应的反应、TPC、DPPH清除活性和FRAP值进行了列表。

3.3 TPC响应面分析

对实验数据进行

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