论文总字数：18267字

摘 要

塔格糖是一种稀有己酮糖，有降血糖，防龋齿等相关功效。为了探索生物法产业化生产D-塔格糖的条件，本课题构建了携带L-AI基因的工程菌并且对酶反应条件进行了优化，通过HPLC和TLC分别对反应液进行了定性和定量的分析，最终得出最适反应条件：65℃恒温条件下、搅拌器转速为200 rpm、反应时长约为48 h，D-半乳糖为200g/L、菌接种量为8%、加入浓度为5 mM的MnCl₂，并加入浓度为10 mmol HEPES，使得pH控制在中性，转化率可超过60%。利用酵母除去残余半乳糖，经过蒸发浓缩和交换树脂分离，最终得到D-塔格糖晶体。本次研究不仅能为D-塔格糖的产业化提供借鉴，其思路和方法也可为其他稀有糖的产业化提供了一个参考。

关键词：D-塔格糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖异构酶（L-AI）、酵母菌

Study on the biological preparation and crystallization of D-tagatose

Abstract

D-tagatose is a rare ketohexose, it has hypoglycemic, caries prevention and other related effects.in order to explore the conditions of industrialized production of D-tagatose by biological method,In this project, engineering bacteria carrying L-AI gene were constructed and the enzyme reaction conditions were optimized.The reaction solution was analyzed qualitatively and quantitatively by HPLC and TLC respectively,finally, the optimal reaction conditions are obtained: under the condition of a constant temperature of 65℃, stirring speed is 200 rpm, the reaction time is 48h, D-galactose is 200 g/L, bacteria liquid concentration was 8%, including the final concentration of 5 mm MnCl2, 10 mmol HEPES buffer, and the pH control in neutral, the conversion can be more than 60%.The residual galactose was removed by yeast, separated by evaporation.This study can not only provide a reference for the industrialization of D-tagatose, but also make a way for the industrialization of other rare sugars.

KEYWORDS: D-tagatose, D-galactose, L-arabinose isomerase (L-AI), yeast

目 录

摘 要 I

ABSTRACT Ⅱ

第一章 文献综述 1

1.1引言 1

1.2 塔格糖 2

1.2.1 塔格糖的性质和相关用途 2

1.3 D-塔格糖的相关制备方法 3

1.3.1 化学法制备D-塔格糖 3

1.3.2 生物法制备D-塔格糖 3

1.4 L-阿拉伯糖异构酶的相关概况 4

1.4.1 L-阿拉伯糖异构酶的相关性质 4

1.5 酵母菌的筛选 5

1.6 本课题的研究内容与意义 6

1.6.1 意义 6

1.6.2 本次课题的研究内容 7

第二章 实验部分 8

2.1 实验材料及实验方法 8

2.1.1 实验菌株及L-AI基因的来源 8

2.1.2 试剂及实验仪器 8

2.1.3 所用培养基和配方 9

2.2 工程菌的构建 10

2.2.1 PCR扩增L-AI基因片段实验 10

2.2.2 质粒扩增菌株和表达菌株的构建 10

2.2.3 工程菌株的培养及诱导表达 11

2.2.4 SDS-PAGE蛋白电泳 11

2.3 酶催化反应的优化 12

2.3.1 前处理实验 12

2.3.2 菌用量的优化 12

2.3.3 底物浓度的优化 12

2.3.4 HPLC实验检验 13

2.3.5 TLC实验检验 14

2.4 最终催化反应及D-塔格糖的浓缩结晶 16

2.4.1 最终催化反应条件 16

2.4.2 酵母菌的初筛 17

2.4.3 酵母菌的复筛 18

2.4.4 D-塔格糖的结晶 18

第三章 结果与展望 19

3.1 结论 19

3.1.1. 工程菌的构建与D-塔格糖的检验 19

3.1.2. 反应条件的优化 20

3.1.3. 酵母菌的筛选 20

3.2 展望 20

参考文献 22

致 谢 23

第一章 文献综述

1.1引言

随着物质文明的不断丰富和我国现代化进程的不断加快，人们的健康意识也越来越强，对自身的健康状况越来越关心，尤其是血糖稳定的注意程度远超以前。众所周知，血糖的相关指标一直是人体健康程度的晴雨表，而当代社会中，高血糖和糖尿病越来越成为威胁人类健康的杀手！依照有关国际组织的相关调查显示：中国已经成为成为糖尿病患者最多的国家，超过了4000万人，而更让人紧张的是，患者的增长率也越来越大，所以在如此严峻的形势下，十多年来，研究人员纷纷把目光聚焦 在了可实现替代蔗糖与葡萄糖并不为人体代谢分解的相关稀有糖和新型甜味剂上，并且寄希望于在相关研究的基础上，开发出可以抑制血糖甚至治愈糖尿病的药物。而本文所研究的塔格糖相关方向之一。

塔格糖是一种天然的六碳糖，是D-果糖的一种同分异构体，与D-半乳糖对应的己酮糖。D-塔格糖的甜度和口感相当于蔗糖，但热值仅为7.3 kJ/g，约为蔗糖能量含量的30%。D-塔格糖不会升高血糖，因此给糖尿病患者带来了福音^[1]；而且，它不会导致蛀牙^[2]。D-塔格糖最近在美国获得了被普遍认为是安全(GRAS)的监管批准^[3]。而且，D-塔格糖还可以作为锁水剂和塑形剂在很多的行业中都有应用。

目前的生产工艺是基于D-半乳糖的异构化，D-半乳糖很容易通过乳糖水解得到^[4]。D-塔格糖的生产因此为缓解全球每年600万吨的速率加快奶酪生产过程中产生的大量乳糖提供了机会^[5]。目前，丹麦-瑞典一些乳制品公司正在与德国有关公司合作，建立生产D-塔格糖的工业流程。

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