论文总字数：20653字

摘 要

四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶都属于四氢嘧啶类物质（ectoines）,ectoines在保护细胞方面有着优良的作用。在生物医药方面如帕金森病，海绵样脑病等神经性疾病有一定的疗效。此外，在化妆品，生物制造，环保等领域均有广阔的前景。本研究为了研究四氢嘧啶羟化酶（EctD）的克隆表达以及探索其最适诱导条件，构建了pET-28(a)-ectD载体，并且在大肠中成功能表达，其蛋白分子量约为35.65kDa，采用SDS-PAGE和高效液相色谱法得到最佳的诱导温度为 30℃，最佳诱导剂浓度为0.05mmoL/L，最佳诱导时间为24小时，此外，我们采用高效液相色谱法检测到产物羟基化四氢嘧啶，这表明重组细胞和粗酶液均能将四氢嘧啶转化为羟基化四氢嘧啶。

关键词：羟基四氢嘧啶 四氢嘧啶 四氢嘧啶羟化酶 诱导表达

Cloning expression and characterization of hydroxylase

Abstract

Both ectoine and hydroxyectoine (ectoines) have excellent protective effects on cells,such as Parkinson's disease , sponge sample encephalopathy and other neurological diseases in biological medicine have certain curative effect, in addition, in the cosmetics, the biological manufacturing, environmental protection and other fields have broad prospects. In this study,ectoine hydroxylase(EctD) from Chromohalobacter Salexigensis was set as the research object exploring its cloning and expression and its optimal induction conditions, we constructed the pET-28(a)-ectD cloning vector and functionally expressed in the Escherichia coli. Its protein molecular weight is about 35.65kDa,we use SDS-PAGE and HPLC to find that the best induction temperature was 30℃，the best Inducer concentration was 0.05mmoL/L and the best Induction time was 24 hours. In addition, we used HPLC to detect hydroxyectoine which means that both the recombinant cells and crude enzyme solution could convert ectoine into hydroxyectoine .

Keywords: Hydroxyectoine; Ectoine; EctD; Induced expression

目 录

摘 要 Ⅰ

Abstract II

第一章 绪论 1

1.1四氢嘧啶羟化酶研究背景 1

1.1.1中度嗜盐菌概述 1

1.1.2相容性溶质简介 1

1.1.3四氢嘧啶类（ectoines）作用 2

1.2羟基化四氢嘧啶简介 2

1.2.1 羟基化酶（hydroxylase） 2

1.2.2 羟基化四氢嘧啶概述 2

1.3 四氢嘧啶羟化酶（EctD）简介 3

1.3.1 EctD的来源 3

1.3.2 EctD的催化反应机理 4

1.3.3 EctD的结构简述 5

1.4 目的基因概述 5

1.4.1 目的基因分离重组 5

1.4.2 EctD基因的表达 5

1.5 本课题的研究解决的相关性问题及研究手段 6

1.5.1 研究相关问题 6

1.5.2 拟采用的研究手段 6

1.6 本课题的研究意义与展望 6

第二章 实验材料与方法 8

2.1实验材料 8

2.1.1基因 8

2.1.2 菌株 8

2.1.3 表达质粒 8

2.1.4 实验试剂 8

2.1.5实验仪器 9

2.1.6培养基及其配置 9

2.1.7 相关溶液及其配制 10

2.2 实验方法 10

2.2.1序列对比 10

2.2.2 质粒构建 10

2.2.3 诱导表达 10

2.2.4诱导表达 11

2.2.5 EctD重组表达条件优化 13

2.2.6EctD酶活的测定 15

第三章 结果与讨论 16

3.1重组质粒验证的结果 16

3.2 EctD的诱导表达结果 16

3.3EctD表达条件优化性质研究结果 18

3.3.1 IPTG浓度的优化 18

3.3.2 EctD诱导温度的优化 19

3.3.3 EctD诱导时间的优化 20

3.4 本章小结 21

3.5 展望 22

参考文献 23

附录 25

致谢 27

第一章 绪论

1.1四氢嘧啶羟化酶研究背景

1.1.1中度嗜盐菌概述

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