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摘 要

植物根围微生物号称植物的“第二基因组”，其与植物的健康息息相关。本研究通过PCR-DGGE分析了黄瓜-草菇轮作模式下菇渣还田对于黄瓜根围微生物多样性的影响，结果表明：黄瓜根围细菌在菇渣处理后群落结构发生明显改变，其中，蓝细菌以及放线菌在菇渣处理后开始在根围微生态系统中出现，并且在处理后第3周开始逐渐趋于动态平衡；根围真菌在处理后变化不显著，主要集中在子囊菌亚亚门，其中粪壳菌亚纲和散囊菌亚纲在处理后逐渐消失。而新出现的条带主要包括子囊菌亚门的丛赤壳科以及担子菌亚门的银耳纲。

关键词： 菇渣还田，根围，微生物多样性

Abstract: The rhizosphere microbiome, which regard as “the second genome” of plant, plays an important tole on the health of the host plant. In this study, PCR-DGGE was carried out to determine the impacts of mushroom residue on the rhizosphere microbial diversity in a Mushroom-Cucumber rotation. Based on the results, the community structure of rhizosphere bacteria shift significantly after treated. Cyanobacteria and Actinomycetes emerged post treated and the rhizobacteria community becoming balanced on the third week; while the shifting of fungi was not significantly and only Ascomycotina involved in. Sordariomycetidae spp. And Eurotiomycetidae spp. Disappeared while Nectriaceae spp. And Tremellomycetes spp. Becoming new members in the rhizosphere.

Keywords: mushroom residue returning, rhizosphere, Microbial diversity

1 前言：

近年来，我国的农业生产取得了举世瞩目的成就，随之而来的是大量农业伴生物质的产生。农作物秸秆与其他废弃物是重要的生物资源, 如何做好农作物秸秆与其他废弃物的就地转化工作已成为亟待解决的农业问题^[1]。据调查统计，2010年全国秸秆可收集量约为7亿吨，其中十三个粮食主产区约为5亿吨，约占全国总量的73%。其中秸秆随意抛弃、焚烧现象严重，带来一系列环境问题^[2]。据农业部的最新调查，2009年全国废弃及焚烧的秸秆资源量约为2.15亿吨，占秸秆资源可收集利用量的31.31%（http://www.ehome. gov.cn/Article /Class14/201101 /7118. html）。秸秆用则利弃则害，为大量废弃的农作物秸秆找到有效的资源化利用途径，已成为当前农业与农村领域迫切需要解决的问题。

图1：植物根围微生物种群互作关系（引自Berendsen et al.,2012），图中绿线代表激活，红线代表抑制，ISR：induced systemic resistance。

目前，对于秸秆的利用主要集中在以下几个方面：肥料、饲料、燃料、原料和基料。除了以上几种单一利用形式之外，从循环经济的角度又进行了多级连用模式的开发。或者将秸秆资源利用与其他农业生产方式结合起来，形成多级循环利用的秸秆资源化利用模式^[3-4]。其中利用秸秆作为基料种植蘑菇，产生的菇渣还田作为肥料使用，不但能够充分利用秸秆中的生物质资源，同时能够建立起有效的轮作方式，在一定程度上缓解单一种植带来的连作障碍，取得了较好的效果，但是还存在一系列问题。比如以往的研究多注重于栽培条件的改善，对于菇渣还田主要考虑肥力效果，而对于其生态效应，特别是对于后茬植物根围微生态的影响关注还不够，不能够明确菇渣还田后植物根围微生态结构变化与植物健康之间的关系。

土壤是一个有机整体，其中土壤微生物是影响土壤性质的主要原因之一。研究表明，土壤微生物总量、活性和有益微生物数量多少是判断土壤质量和健康状况的重要指标^[5]。特别是号称“植物第二基因组”的根围微生物与植物健康的关系息息相关^[6]（图1）。

植物在生长过程中将40%左右的光合作用产物都通过根分泌到了根围土壤中^[7]，从而使得植物根围微生物的种群密度远远高于非根围土壤，这就是“根围效应”^[8]。据报道每克根表面最高可以分布10¹¹个微生物细胞^[9]。其中原核微生物的种类在3万种以上^[10]。根据对寄主植物的影响可以把根围微生物分为3个主要的类群：即病原微生物、有益微生物以及占主要部分的其它既无害也无益的类群，这三个类群在农业生产中会随着农药、化肥的使用以及农业措施的改变而发生变化，当达到动态平衡时，其中成为优势种群的微生物会通过自身作用表现出对于寄主植物的相关影响^[11-12]。

因此，探明菇渣还田后植物根围微生物多样性，有益种群及病原菌动态变化以及与植物健康与否的关系非常重要。本研究旨在通过PCR-DGGE方法分析黄瓜-草菇轮作模式下菇渣还田对于黄瓜根围微生物多样性的影响，从根围微生物的角度为菇渣还田提供理论基础。

2 材料与方法

2.1 实验设计

本研究以淮阴地区推广的黄瓜-草菇轮作模式作为研究对象。分别在菇渣翻耕前，菇渣翻耕后1天、1周、3周、7周、11周、15周、19周采集黄瓜根围土壤进行微生物多样性分析。

2.2 草菇-黄瓜轮作模式

本研究以淮安黄瓜-草菇轮作模式为研究对象。该模式主要特点为一茬黄瓜二茬草菇的种植模式。9月底10月初育苗冬春黄瓜，嫁接。11月上旬种植黄瓜苗，经过一个月的生长到12月中上旬采收。到了来年5月底种植第一茬草菇，时隔一个月采收第一茬草菇，过一个月清除第一茬草菇，清除第一茬的同时播种第二茬草菇，到了8月上旬开始采收第二茬草菇。

2.3 土壤采集方式

整个土壤采集过程采用五点取样法，每点选取黄瓜植株三株，首先将黄瓜植株拔出，轻轻抖动以去除粘附的大量土壤，再利用毛刷轻轻刷下紧贴在黄瓜根部的根围土，装入塑封袋放在冰盒中带回实验室，样品前期处理后研磨过2mm筛。进行土壤总DNA 的提取、进行PCR-DGGE分析，部分置于阴凉通风处自然干燥至恒重，用作土壤理化性质及酶活性检测。剩余的则置于-20℃冰箱保存备用。

2.4 微生物多样性检测方法

2.4.1 土壤DNA的提取

本实验是利用FastDNA SPIN Kit for Soil（MPbio，USA）试剂盒进行总DNA的提取用于变性梯度凝胶电泳分析（DGGE）。提取方法参照试剂盒实验说明。

2.4.2 根围细菌PCR-DGGE分析

首先以基因组DNA为模板、采用通用引物GC-338F和518R扩增16S rDNA 的高变区序列。

表1：黄瓜根围细菌DGGE扩增引物

Primer	Sequence
338F	CCT ACG GGA GGC AGC AG
518R	ATT ACC GCG GCT GCT GG
GC338F	CGCCCGGGGCGCGCCCCGGGGCGGGGCGGGGGCGCGGGGGG CCT ACG GGA GGC AGC AG

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2.5 mM）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；GC-338F（20 mM）1 μL；518R（20 mM）1 μL；模板DNA 100 ng；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s、55℃复性30 s、72℃延伸30 s、30个循环；最终72℃延伸10 min。

PCR产物采用AXYGEN公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

取10 μL PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析。采用变形梯度为35%～55%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%（v/v）的去离子甲酰胺）在1×TAE缓冲液中150V 60℃下电泳4小时。

表2：35%-55%变性梯度水平DGGE凝胶配方：

	35%	55%
30% Acrylamide/Bis	4 mL	4 mL
50 x TAE buffer	0.3 mL	0.3 mL
Formamide (deionized)	2.1 mL	3.3 mL
Urea	2.205 g	3.465 g
dH2O	To 15 mL	To 15 mL
APS	120 μL	120 μL
TEMED	10 μL	10 μL

变性梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后、采用银染法染色。

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。

以2 μL回收产物为模板，338F/518R为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2.5 mM）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；338F（20 mM）1 μL；514R（20 mM）1 μL；模板DNA 1 μL；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后，72℃延伸10 min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到pEASY-T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。

将序列提交到GenBank数据库。在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的16S rDNA序列。采用MEGA5软件，Neighbor-joining法构建系统发育树，自展数（bootstrap）为1000。

2.4.3 根围真菌PCR-DGGE分析

首先以基因组DNA为模板、采用通用引物扩增高变区序列。

表3：黄瓜根围真菌DGGE扩增引物

Primer	Sequence
NS1	GTA GTC ATA TGC TFG TCTC
Fung	CATTCCCCGTTACCCGTTG
GC-Fung	CGC CCG CCGCGC CCCGCG CCCGGC CCG CCGCCCCCGCCCCATTCCCCGTTACCCGTTG

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2.5 mM）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；GC-Fung（20 mM）1 μL；FUNG（20 mM）1 μL；模板DNA 100 ng；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性5 min； 94℃变性30 s、55℃复性30 s、72℃延伸30 s、30个循环；最终72℃延伸10 min。

PCR产物采用AXYGEN公司DNA Gel Extraction Kit纯化回收。

取10 μL PCR的产物进行变形梯度凝胶电泳（DGGE）分析。采用变形梯度为25%～40%、浓度为8%的聚丙烯酰胺凝胶（化学变性剂为100%尿素7 mol/L和40%（v/v）的去离子甲酰胺）在1×TAE缓冲液中150V 60℃下电泳8小时。

表4：20%-40%变性梯度的水平DGGE凝胶配方：

	20%	40%
30% Acrylamide/Bis	4 mL	4 mL
50 x TAE buffer	0.3 mL	0.3 mL
Formamide (deionized)	2.1 mL	3.3 mL
Urea	2.205 g	3.465 g
dH2O	To 15 mL	To 15 mL
APS	120 μL	120 μL
TEMED	10 μL	10 μL

变性梯度凝胶电泳（DGGE）完毕后、采用银染法染色。

用灭菌的手术刀切下待回收DGGE条带，采用OMEGA 公司Poly-Gel DNA Extraction Kit回收目的条带。

以2 μL回收产物为模板，NS1为引物进行PCR扩增。

PCR扩增体系（50 μL）为：10× PCR buffer 5 μL；dNTP（2.5 mM）3.2 μL；rTaq（5 U/μL）0.4 μL；NS1（20 mM）1 μL；fung（20 mM）1 μL；模板DNA 1 μL；补ddH2O至50 μL。

PCR扩增程序为：94℃预变性4 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后，72℃延伸10 min。

将重新扩增的DNA片段切胶回收、纯化后，连接到PMD-18T载体上，并转化至DH5α感受态细胞中，筛选阳性克隆，进行序列测定。

将序列提交到GenBank数据库。在GenBank中使用Blast程序进行同源性比较，获得最相似典型菌株的18S rDNA序列。采用MEGA5软件，Neighbor-joining法构建系统发育树，自展数（bootstrap）为1000。

2.5主成分分析

银染后的DGGE 图谱用BioRad GS800 光密度仪扫描，得到的结果采用Gel Compare4.5（version 4.5.Applied Maths, Kortrijk, Belgium）进行聚类分析。采用Pearson correlation indices of similarity 和平均连锁法(unweighted pair-group method using arithmeticaverages UPGMA) 绘制聚类树状图。然后将所得到的densitometric curves 输出通过Canoco4.5(Microcomputer Power, Ithaca USA)进行PCA分析。

3结果与分析

3.1 根围细菌多样性分析结果

图1：黄瓜根围细菌DGGE图谱

注：泳道排列顺序：13-15，第0天；16-18，第1天；19-21，第1周；22-24，第3周；1-3，第7周；4-6，第11周；7-9；第15周；10-12，第19周。

图2：黄瓜根围细菌多样性与采样时间的PCA分析

注：图中1-24表示按照采样时间排序的24个土壤样品。

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