硫酸镉和alpha;-萘对斑马鱼胚胎的发育个别及连带的毒性作用*

Jian YIN^dagger;1, Jian-ming YANG¹, Feng ZHANG², Peng MIAO^1,3, Ying LIN¹, Ming-li CHEN¹

(¹CAS Key Lab of Bio-Medical Diagnostics, Suzhou Institute of Biomedical Engineering and Technology,

Chinese Academic of Sciences, Suzhou 215163, China)

(²Suzhou Xiexin Photovoltaic Technology Co., Ltd., Suzhou 215163, China)

(³University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

^dagger;E-mail: yinj@sibet.ac.cn

Received Apr. 3, 2014; Revision accepted July 23, 2014; Crosschecked Aug. 15, 2014

摘要：本文旨在探讨硫酸镉（硫酸铜），并在斑马鱼胚胎alpha;-萘（AND）的个别及连带毒性。其结果是，硫酸镉引起两个致死和亚致死效应，例如24小时后受精（HPF）死亡和72 HPF延迟孵化。然而，ANF不仅造成亚致死效应，包括48 HPF心脏性水肿和72 HPF延迟孵化。以24 HPF死亡和48 HPF心脏性水肿为端点，硫酸镉和ANF的毒性彼此均显著增强。一致，既硫酸镉和ANF引起显著氧化应激，包括在还原谷胱甘肽（GSH）水平，抑制超氧化物的DIS-酸变位酶（SOD）的活性降低，以及在斑马鱼胚胎增加丙二醛（MDA）的含量，但这些组合-tures的生物标记物产生更为显著改变。硫酸镉和ANF的共处理显著下调多药耐药相关蛋白（MRP）1和细胞色素P450（CYP）1a中，它构成了斑马鱼胚胎到化学毒素的保护机制的mRNA水平。总之，硫酸镉和ANF的联合治疗显示出在斑马鱼胚胎比单独治疗更严重的损害。同时，生产氧化应激和MRP1和CYP1A表达的改变可能的是这样联合毒性的重要组成部分。

关键词：联合毒性，硫酸镉，alpha;-萘，斑马鱼胚胎，氧化应激DOI：10.1631/ jzus.B1400091文献标识码：A中图分类号：Q89

正文

1引言

水生生物通常面临着可变的OU种在水中的化学毒物，因而从这些混合物的不可预知的相互作用（Duan等，2008;玛丽亚和Bebianno，2011）受苦。不幸的是，虽然有对特定化合物的毒性是大量调查（Shi等，2008; Osterbauer等人，2011），关于污染物的共同影响的信息仍然不足。

镉是最重要的重金属毒物之一及其环境浓度，由于其在现代工业广泛利用日益增加。镉报道引起许多有害的影响，包括受损的神经，眼缺陷，并孵化失败在水生生物（Chow等人，2008;Matović等人，2011）。各种实验已经完成对斑马鱼，金头鲷，和金头鲷的幼虫，结果表明，镉的毒性是由细胞色素P450（CYP）1A前PRESSION的抑制以及生产氧化应激（造成萨西等，2013; Souid等，2013; Wang和加拉格尔，2013）。

多环芳烃（PAH），对另一方面，由大量不同结构的化合物，并日益受到漏油，车辆尾气排放和农业/工业活动释放。在水生系统，如苯并多环芳烃[alpha;]芘和惹烯构成显著的威胁，如心包水肿，颅面畸形，并在鱼的视觉系统发育的改变（Fleming和朱利奥，2011; Hawliczek等，2012; Huang等人，2014年）。和这种威胁据说与由CYP1A代谢以及氧化应激的水平提高（Timme-Laragy等人，2007）。

三磷酸腺苷结合盒（ABC）转运，如多药耐药相关蛋白（MRP）基因的1-5，也被认为参与了镉和多环芳烃的解毒作用。高表达，这些跨搬运工的作用已在鱼类，如斑马鱼被发现（Long等，2011A，2011B）和虹鳟鱼（Kennedy等，2014年）。它们的基因表达可通过各种异生素如镉和多环芳烃，抽母体化合物及其代谢物出生物体中能量依赖性过程被诱导（Long等，2011C; Costa等人，2012; Navarro等。 ，2012）。因此，ABC转运通常被认为是生物体对这些环境化学保护的主要生物防御机制。

由于它们的广泛应用，镉和多环芳烃通常在环境共存（Zhang等人，2004;基南等人，2010），并在鱼类这些化学物质的相互作用可能会发生由于氧化应激和参与的类似感应的CYP1A和ABC转运。然而，这种跨行动从未研究过在以前的experi-求。在本文中，斑马鱼胚胎，这代表-讨厌一个有吸引力的模型为研究环境化学品的毒性机制（Berry等人，2007;威尔等人，2009年），被用来考察硫酸镉的个别及连带效应（硫酸镉）和一个模型的PAH，alpha;萘黄酮（AND）（Timme-Laragy等人，2007）。为了评估氧化应激，ABC转运和CYP1A在联合毒性中的作用，引起（GSH）水平，超氧化物歧化酶（SOD）活性，丙二醛（MDA）含量，MRP1和CYP1A表达减少gluta硫酮的改变硫酸镉，ANF，和硫酸镉-ANF混合物分别评价。

2。材料和方法

2.1试剂

无论硫酸镉和ANF从国药集团化学试剂有限公司（上海，中国）获得的，其纯度为99％以上。从生物技术研究所碧云天（中国南通）获得了GSH含量，SOD活性，MDA含量套件。其他试剂均为试剂级，并从当地供应商处购买.

2.2斑马鱼

成人wide-型斑马鱼从当地水族箱（苏州，中国）购买并保持为前（Berry等人，2007年）中所述。收集鱼卵和Holtfreter的缓冲液洗涤三次（3.5克/升的NaCl，0.05克/升的KCl，0.1克/升CaCl 2和0.025克/升碳酸氢钠; pH值7.5）。使用Axio上观察A1显微镜（卡尔蔡司公司，奥伯 - kochen，德国），收集鸡蛋的状态，目测确定，任何死卵被丢弃。在4小时后受精（HPF），收集并置于24孔板的良好品质的鸡蛋，使得每个孔含有10胚胎，并用于发育毒性测定（蒂尔顿和坦圭，2008）。

2.3发育毒性试验

硫酸镉溶解于Holtfreter的缓冲二叔rectly使用之前。 ANF溶于丙酮，然后再在Holtfreter的缓冲液中稀释。在每个治疗-包换，丙酮的浓度是不超过0.1％，这造成在胚胎的发育没有显著改变。

在4 HPF，在24孔板鸡蛋液用Holtfreter的缓冲区并暴露于含有所述车辆，硫酸镉，ANF，或硫酸镉-ANF混合物2毫升Holtfreter的缓冲区。每个组包含至少六个重复，和由0.1％的丙酮处理鸡蛋充当媒介物对照。此外，透明塑料薄膜用于覆盖的孔中。各孔的曝光溶液的一半被移除，然后用新鲜曝光溶液每日更换。均值，同时，动物尸体被拆除。在24，48，和72 HPF，由车辆控制处理的斑马鱼胚胎（图1a和1c）和化学品（图1B和1D）的发展状况，用显微镜观察，并用A2000IS载入文件摄像头（柯南股份有限公司，北京，中国）。选定的终点包括24 HPF死亡，48 HPF车两端交流开关元件水肿（图1b）和72 HPF延迟孵化（图1D和1E）。

更具体地识别硫酸镉的毒性ANF的影响，我们还进行了一个前periment其中胚首先由75 mg / L的硫酸铜单独处理，然后再12小时后，液用Holtfreter的缓冲区的胚胎，并暴露为75毫克/升硫酸镉和1.5毫克/升ANF的混合物。 20小时处理（16-36 HPF）后斑马鱼胚胎的死亡率随后记录和仅由硫酸镉（4-36 HPF）或硫酸镉的同时治疗和ANF（4-24 HPF）处理的组相比。

2.4 GSH，MDA，SOD及检测

在24，36，和48 HPF，洗涤三套60胚胎在两个车辆控制和化学治疗基团与Holtfreter的缓冲区并收集到1.5毫升离心管中。各管中填充用300mu;l磷酸盐缓冲液（PBS; pH 7.4）中，并浸入液氮中进行20秒。在这之后，在PBS中的胚胎进行机械匀化（韦根等人，1999年）。上清液胚胎匀浆（10000times;g下，4℃，10分钟）为一生物标志物测定的离心分离后收集。

GSH含量，SOD活性，MDA含量，用市售试剂盒进行检测。使用检测上清液中的蛋白质含量,二喹啉酸法（沃克，1994）。谷胱甘肽水平通过的5 - 硫代-2-硝基苯甲酸（412纳米）的形成来确定（郝等人，2013年）。超氧化物歧化酶活性通过氮蓝四唑/核黄素光度定量方法（420毫微米）（Janknegt等人，2007）进行检测。使用硫代巴比妥酸测定法（535毫微米）检测MDA含量（董等人，2013年）。所有的生物标志物检测用的协同HT多模微量板读数器（BIO-Tek的仪器公司，美国佛蒙特州）进行。在此之后，所有的生物标志物标准化为总蛋白含量，并表示为通过车辆处理的组的每个百分比。

2.5反向transcriptase-聚合酶链反应（RT-PCR）CYP1A和MRP1分析

在24和48 HPF，由溶媒处理的斑马鱼胚胎，75毫克/升硫酸镉，1.5毫克/升ANF，或75毫克/升硫酸镉和1.5mg混合物/ L的ANF收集。活的人被用于提取总RNA用市售试剂盒（爱思进科学，公司，美国）。 RNA的质量通过使用NanoDrop2000分光光度计（的Thermo Fisher Scientific公司，美国）260/280纳米吸收检查。如先前由岛等人所述制备第一链cDNA。 （2012）。在此之后，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH），MRP1和CYP1A从用PCR的第一链cDNA扩增。在这些中，GAPDH被设定为看家基因。 GAPDH基因引物序列，MRP1，和CYP1A（表1）用引物总理5.0软件（总理，公司，加拿大）的设计。

2.6统计学分析

所有的实验数据被表示为三组独立实验，这随后用统计软件包社会科学（SPSS）v.15.0（美国芝加哥）分析平均值plusmn;标准差（SD）。被每次形成方差（ANOVA）对多个组和Tukey的两个不同的治疗方法的HSD检验单向分析分别比较数据。在所有的情况下，数据差异当Plt;0.05具有统计学显著。

3结果

硫酸铜和和3.1个人毒性

如图。图1和2，由车辆控制（0.1％丙酮）exhib-资讯科技教育无显著改变处理斑马鱼的胚胎。硫酸镉透露双方致死和差亚致死效应，如24 HPF死亡和72 HPF延迟孵化（图1d）。然而，只有亚致死效果，如48 HPF心脏水肿（图1b）和72 HPF延迟孵化（图1e），观察ANF。此外，获得了这两个有毒化合物浓度依赖性毒性作用，并在图中示出。 2。例如，将胚胎在24 HPF的死亡率为治疗的100毫克/升硫酸镉后（10.00plusmn;4.61）％，而所有的胚胎在24 HPF当暴露在300毫克/升硫酸镉死亡。 20毫克的治疗/ L的硫酸镉所引起的（17.50plusmn;5.00）％延迟孵化率72高倍视野，而当胚胎75 mg / L的硫酸镉处理的延迟孵化率提高到100％。对于ANF，类似的趋势也被发现。例如，暴露于1毫克/升ANF导致的（26.25plusmn;10.15）％一车两端交流开关元件水肿率在48高倍视野，而

几乎所有的胚胎的3毫克/升ANF治疗后出现心脏性水肿在48高倍视野。

3.2硫酸镉和ANF联合毒性

自24 HPF死亡只有在发生硫酸镉处理，48 HPF胚胎心脏性水肿ANF的治疗之后才观察到的胚胎，他们被选定为端点，硫酸镉和ANF的联合毒性的调查。其结果是，硫酸镉和ANF的毒性可以显著由彼此（图3）增强。例如，75毫克/升硫酸镉或1.5毫克治疗/ L的ANF单独没有引起斑马鱼胚胎的任何死亡，但1.5毫克/升ANF和75毫克的共处理/ L的硫酸镉导致的24 HPF死亡率（31.11plusmn;6.12）％。此外，所有的胚胎死亡24高倍视野暴露于1.5毫克/升ANF和150毫克/升硫酸镉共 - 处理后，而当由硫酸镉或ANF单独（Pgt; 0.05）处理他们都活着。同样，1.5毫克/升ANF和75毫克的治疗/ L的硫酸镉导致的分别（58.33plusmn;12.93）％和0，48 HPF心脏水肿率，但心脏水肿率（85.00plusmn;4.25）％时的胚胎由75 mg / L的硫酸镉和1.5毫克/升ANF（P lt;0.001）的组合处理。

3.3硫酸铜和ANF的个体治疗改变的斑马鱼胚胎的氧化应激状态

通常，硫酸铜和ANF造成谷胱甘肽水平，超氧化物歧化酶活性的浓度和时间依赖性改变，和MDA含量（图4）。例如，在24高倍视野SOD活性不受100毫克/升硫酸镉，但它减少了9％，当由200毫克/升硫酸镉处理。同时，超氧化物歧化酶活性的48 HPF的减少是约25％时，胚胎由200毫克/升硫酸镉（图4a和4b）处理。

Table 1 Specific primer sequences used in this experiment

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