酶辅助微波从芽野菊花提取总黄酮和生物活性评价

摘要：运用酶辅助微波提取法从芽野菊花总黄酮产量的影响因素提取总黄酮进行了研究，采用响应面优化设计，这种提取方法与水加热提取法进行了比较。总黄酮的抗氧化和抗菌活性进行了初步评价。结果表明，优化微波提取条件为：水–材料比25:1（ML：G）；提取时间、微波功率：19min；582w。在此条件下，总黄酮得率为11.21plusmn;1.12%，这是高于53.21%的水加热提取方法，具有提取时间短。最大的清除衰老的总黄酮量（12mg/ml）对DPPH自由基、羟基和超氧阴离子自由基分别为76.6%、78.8%和58.2%。总黄酮对枯草芽孢杆菌的抑制作用，大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和酿酒酵母，最小抑菌浓度分别为8mg／ml，4mg/ml，4mg／ml和8mg／ml。本文的研究为从花蕾C. indicum L.总黄酮提取的进一步优化提供技术依据。

关键词：野菊花，黄酮，提取、酶处理、微波、活性

1.介绍

在中国芽的野菊花被称为Jumi，属于C. indicum L.的家庭，是一种草本植物，广泛生长在中国和韩国^[1]。一系列研究表明，野菊花属具有较强的抗菌、抗突变、抗氧化和抗炎作用^[2-4]。花和芽C. indicum L.传统上被用来治疗各种免疫相关的疾病，高血压的症状和一些感染性疾病如肺炎、肠炎、口炎、在中国和韩国的民间几千年中医热病^[5,6]。此外，花和芽也常用茶治疗中药一些眼部疾病^[1]。

黄酮类化合物是许多药用植物的重要生物活性成分，具有抗氧化和保肝作用。此外，黄酮类化合物具有广泛的药理特性，包括抗癌和抗病毒活性，免疫细胞的稳定性，抑制细胞的增殖，防止血小板聚集，降低低密度脂蛋白的氧化和血管平滑肌松弛保护^[7,8]。从花蕾C. indicum L.总黄酮的提取是传统水加热提取方法通常进行的，这是费力和耗时的，并且需要大量的溶剂。

酶处理是食品工业中一个新兴的技术，广泛应用于各种陆地植物活性成分的提取，具有提取率高的优点，降低成本和能源需求，在较短的时间内，高重复性，操作简单^[9-11]。微波治疗常采用在提取、强化传热和传质过程^[12,13]。经微波处理后，与传统提取工艺的比较，提取率显著提高了速度和效率^[14-16]。在酶处理结合从芽C. indicum L.提取总黄酮微波提取中的应用报告中，微波萃取已广泛应用于药用植物活性成分的提取。

在目前的工作中，酶辅助微波萃取法被应用于芽C. indicum L.总黄酮的提取。微波萃取条件进行了优化，初步评价了总黄酮的抗氧化和抑菌活性。

2．材料和方法

2.1材料与试剂

野菊花芽是由浙江遂昌开发有限公司提供，公司（溧水，中国）。使用前在60°C干燥，粉碎成一定粒径（平均直径1mm）的粉碎机，并保持干燥。纤维素酶（gt; 15u／mg）是来自上海的蓝吉科技发展有限公司购买的，公司（上海，中国）。槲皮苷标准（纯度98%）是国药集团化学试剂有限公司购买，公司（上海，中国）。分析级试剂分别来自天津永大化学试剂开发中心购买（天津，中国）和高效液相色谱级溶剂从tedia公司购买（美国）。wf-4000c微波萃取系统是由上海欧盟微波化学技术有限公司提供，公司（上海，中国）。

2.2总黄酮的提取

10克C. indicum L.芽粉加入到锥形瓶中，然后80ml（DHP）磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH 6）加入，其次是纤维素酶添加量为0.4g。混合40°C水浴振荡30 min，酶处理后，水被加入到混合物中，其次是处理与合适的微波功率的微波萃取（W）、水–原料配比（水的体积：粉末的质量，ML：G）和提取时间（分钟）。提取后，将混合物离心3170times;g10min，取上清液被吸收到一个大孔树脂（HPD-100），其次是洗脱70%（v/v）乙醇。在洗脱液浓缩干燥，得到产品的总黄酮，并用紫外-可见分光计测试分析。每个实验组重复三次。总黄酮得率表示为产量（%）=（M / M）times;100%，其中M是在产品通过UV-Vis分析总黄酮量（G），和M是C. indicum L.芽重（g）。

2.3响应曲面法Box–Behnken设计

在适当条件下酶促处理的基础上，进行微波提取，并通过单因素实验考察了提取工艺参数。结果表明，水–物料比、提取时间、微波功率对总黄酮得率的影响显著，与最优值如下：水–材料比20:1（ML：G）；提取时间25 min，微波功率500 W；，Box–Behnken设计（BBD）响应面方法论（RSM）应用于进一步优化提取参数使用软件设计专家（试用版本7.1.6，统计方便，公司，MN，美国）。根据初步的实验结果，–水料比、提取时间、微波功率为关键参数，并分别命名为Z1，Z2和Z3，分别。转换后，对BBD的变量如下：X1 =（Z1minus;20）/ 5；x2=（Z2minus;20）/ 10；X3 =（Z3minus;500）/ 100。表1显示了变量及其级别的范围。

表一：独立变量和它们的水平为BBD。

2.4抗氧化活性的测定

2.4.1 DPPH自由基清除能力

两毫升C. indicum L.芽总黄酮溶液不同浓度（2–12mg/ml）混合与DPPH乙醇溶液等体积（2times;10minus;4米）。反应混合物摇匀，将在一个黑暗的地方，室温30min，然后吸光度测定517nm使用紫外可见分光光度计。根据方程计算了总黄酮对DPPH自由基的清除能力：清除率（%）=(%) = [1minus;(A1minus;A2)/A0]*100 %，其中A₁是反应混合物的吸光度，A₂是反应混合物的吸光度不自由，和A₀的反应混合物的吸光度没有总黄酮。

2.4.2羟基自由基的清除能力

芬顿反应系统（邻二氮杂菲-Fe² H2O2）经常被用来产生羟基自由基（·OH）。邻二氮杂菲-Fe2 水木糖基氧化形成邻二氮杂菲-Fe³ ，然后最大吸收峰消失。0.2毫升0.2毫升7.5毫米邻二氮杂菲溶液，7.5毫米的硫酸亚铁溶液，pH 7.47的Tris-HCl缓冲溶液1 mL，7.5 M H2O2溶液和0.1毫升C. indicum L.芽总黄酮溶液不同浓度1 ml加入10 mL比色管中，每次加入后搅拌。加入双蒸馏水调整体积为10毫升。混合物在37℃下孵育1小时。冷却后，在536 nm的紫外-可见分光光度计计通过测定吸光度，以水为空白对照。总黄酮对羟自由基的清除能力计算如下：清除率（%）= [（A2minus;A1）/（A0minus;A1）]times;100%，其中A0无H2O2或样品的反应混合物的吸光度，A1吸光度与H2O2反应混合物而不是样品，和A2是与H2O2反应混合物的吸光度与样品。

2.4.3超氧阴离子自由基清除能力

2.8毫升盐酸缓冲液（0.05M，pH值8.2）加入比色管，然后在25°C水浴中预热。0.1毫升的野菊花总黄酮类L.芽与溶液浓度和0.1毫升的溶液（2.5毫米）增加。该混合物在25 C孵育4 min°两滴盐酸溶液（10毫米）加入终止反应。用紫外可见分光光度计测定536 nm处的吸光度。计算是对超氧阴离子自由基的清除能力总黄酮：清除率（%）= [ 1minus;（A1minus;A2）/ A0 ]times;100%，其中A0吸光度反应混合物三酚但不是焦性没食子酸、焦性没食子酸和A1与样品反应混合物的吸收平衡，和A2的反应混合物的吸光度无样本而不是焦性没食子酸。

2.4.4抗菌活性测定

五菌株的培养基（细菌：枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌；霉菌：曲霉尼日尔；酵母:酿酒酵母）制备参照文献[ 17 ]。五株接种于斜面培养基中，随后培养（细菌，27°C，24小时；霉菌和酵母，27°C，48小时）。在无菌水三角瓶中取出活性菌株。摇瓶10分钟后，得到浓度为107～108 CFU／ml的菌株悬浮液。

制备出直径为6毫米的圆形滤纸。灭菌后，它被浸泡到C. indicum L.芽总黄酮溶液不同浓度30分钟培养基融化，倒入培养皿。培养基完全固化后，将0.2 ml菌株接种于斜面培养基中，然后均匀涂布。用总黄酮溶液浸泡的滤纸三张，轻轻贴在板上，间隔一定距离。以无菌水浸泡滤纸三份作为空白对照。每种菌株重复三次。接种的菌株在培养箱中倒置培养（细菌，37℃，24小时，真菌和酵母，27°C，48小时）。抑菌圈的大小测量。根据上述程序，测定了不同菌株对总黄酮的最低抑菌浓度。

2.5数据分析

试验进行三次，结果均以平均数为标准。微波萃取试验由BBD数据通过软件分析设计专家7.1.6（STAT缓解，公司，MN，美国）。方差分析采用SPSS11.5统计软件（SPSS公司进行，IL，美国）。P＜0.05被认为是显著不同的。

3.结果和讨论

3.1微波萃取参数的优化

在这项研究中，总共有17个实验运行采用随机顺序。所有实验重复三次。结果见表2。多项式方程，描述总黄酮得率（Y）为水–材料比同步功能（X1）、提取时间（X2）和微波功率（X3），表现为如下关系：Y = 11.26 0.22X₁ 0.29X₂ 0.32X₃– 0.36X₁X₂ 0.20X₁X₃–0.26X₂X₃–0.37X₁²–1.48X₂²–0.33X₃²。

表3显示了所选二次模型的方差分析的摘要。对实验数据进行拟合，二次模型的方差分析和响应面回归模型具有高度显著性（P＜0.0001）具有非常高的F值（39.93）。影响总黄酮得率的因素依次为：微波功率（X3）gt;提取时间（X2）gt;水–物料比（X1）。X₁、X₁、X₁X₂，X₁²和X₂²对总黄酮得率的影响非常显著（P＜0.01），而X1₁，x₂x₃和X₃²对总黄酮得率的影响显著（P＜0.05）。

Table 2: Box–Behnken-Burman实验设计和实验结果

表3：总黄酮产量回归模型方差分析结果。