摘 要

γ-聚谷氨酸（γ-PGA）由谷氨酸单体通过γ-酰胺键连接而成的一种特殊结构生物高分子。目前报道的γ-PGA 产生菌可以分为两类：一类为谷氨酸依赖型，另一类是谷氨酸非依赖型。目前，非粮作物的开发和利用已成为突破点，菊芋具有耐干旱，易种植，产量极高，价格便宜而作为一种重要的果聚糖来源。为了挖掘菊芋在γ-PGA工业化生产中的运用，本课题组前期分离筛选得到一株不依赖谷氨酸能用利用菊糖从头合成γ-PGA的生产菌株Bacillus amyloliquefaciens NX-2S。通过发酵优化发现B. amyloliquefaciens NX-2S虽然能够代谢菊糖积累γ-PGA,但其对于菊糖的较慢消耗能力仍然导致了较长的发酵时间且发酵结束仍然有菊糖剩余。因此有必要通过分子手段对野生菌B. amyloliquefaciens NX-2S利用菊粉能力进行改造。

本文拟从不同菊粉酶产生菌中筛选挖掘得到较好的菊粉水解元件，通过搭建在野生菌Bacillus amyloliquefaciens NX-2S胞外分泌平台，对菊粉水解酶的信号肽进行胞外分泌表达优化，考察重组聚谷氨酸生产菌在菊粉利用与合成聚谷氨酸的能力进行评价。实现γ-聚谷氨酸野生菌对菊糖强化利用，从而打造一株高效水解非粮原料菊粉生产聚谷氨酸的模式出发菌株。

关键词：γ-聚谷氨酸 解淀粉芽孢杆菌 菊糖 胞外分泌

Construction of non - glutamate - dependent extracellular secretion platform of polyglutamic acid - producing bacteria

Abstract

γ-polyglutamic acid (γ-PGA) from the glutamic acid monomer through the γ-amide bond is a special structural biopolymer. Currently reported γ-PGA-producing bacteria can be divided into two categories: one for the glutamate-dependent type, the other is glutamate-dependent. At present, the development and utilization of non-grain crops has become a breakthrough point, Jerusalem artichoke is resistant to drought, easy to grow, high yield, cheap and as an important source of fructans. In order to tap the use of Jerusalem artichoke in the industrial production of γ-PGA, this group was preliminarily separated and screened to obtain a strain of Bacillus amyloliquefaciens NX-2S which could inhibit the synthesis of γ-PGA from inulin without using glutamate. Through the fermentation optimization, B. amyloliquefaciens NX-2S, although capable of metabolizing the accumulation of γ-PGA in the inulin, still had a longer fermentation time for the slower consumption of the inulin and the remainder of the fermentation at the end of the fermentation. Therefore, it is necessary to use molecular means to modify the wild mushroom B. amyloliquefaciens NX-2S using inulin capacity.

In this paper, a good inulin hydrolyzable element was obtained from the screening of different inulinase producing bacteria, and the expression of extracellular secretion of the signal peptide of inulinase hydrolase was optimized by constructing the extracellular secretion platform of Bacillus amyloliquefaciens NX-2S. Recombinant polyglutamic acid-producing bacteria were evaluated in the ability of the inulin to utilize and synthesize polyglutamic acid. To achieve γ-polyglutamic acid wild mushroom to strengthen the use of inulin, thereby creating a highly efficient hydrolysis of non-food raw materials inulin production of polyglutamic acid pattern of the starting strains.

Key words: γ-polyglutamic acid; Bacillus amyloliquefaciens; Inulin; Extracellular secretion

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 菊粉酶的研究概况 1

1.2 γ-聚谷氨酸的概述 1

1.2.1 γ-聚谷氨酸的结构特点 1

1.2.2 生产γ-PGA的菌株 2

1.2.3 非谷氨酸依赖型γ-PGA产生菌的研究进展 2

1.3 解淀粉芽孢杆菌的研究进程 3

1.3.1 解淀粉芽孢杆菌概述 3

1.3.2 解淀粉芽孢杆菌遗传工程 3

1.3.3 信号肽的概述 3

1.4本课题研究背景及方向 4

第二章 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 菌株与质粒 5

2.1.2培养基及试剂配制 5

2.1.3 实验试剂 6

2.1.4 主要仪器 6

2.1.4培养条件 7

2.1.5 PCR 引物 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 解淀粉芽孢杆菌质粒的提取 8

2.2.2质粒 DNA 的酶切 8

2.2.3 琼脂糖凝胶电泳和胶回收 8

2.2.4 载体和目的片段的连接 9

2.2.5 PCR 反应和 DNA 片段的测序 9

2.2.6解淀粉芽孢杆菌的电转化 9

2.2.7不同菊粉外切酶分泌表达重组质粒的构建 10

2.2.8不同菊粉外切酶元件在野生菌B.amyloliquefaciens NX-2S1的分泌表达 10

2.2.9 对筛选的元件的信号肽进行胞外分泌表达优化 11

第三章 结果与讨论 12

3.1 不同来源的菌属菊糖代谢能力的发酵考察 12

3.2 不同来源的菊粉外切酶在B.amyloliquefaciens NX-2S1重组菌的表达及筛选 13

3.2.1 不同菊粉外切酶分泌表达重组质粒的构建 13

3.2.2 不同菊粉外切酶元件在野生菌B.amyloliquefaciens NX-2S1的分泌表达 14

3.3 地衣芽孢杆菌NQ-1来源的果聚糖酶（sacC）在B. amyloliquefaciens NX-2S1胞外分泌信号肽优化 14

3.4 重组菌株的7.5 Lγ-PGA发酵考察 16

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献： 18

致谢 20

第一章 文献综述

1.1 菊粉酶的研究概况

菊粉，很多时候又被称为菊糖。它是由很多个果糖大分子，在β-2,1-果糖苷键的作用下，将其连接起来，从而形成的多聚果糖，这种结构是一种直链的结构。我们一般只把这种大分子的聚合度在30左右的才称作是菊粉^[1,2]。菊粉作为一种多糖类的物质,，它的的产出群体很多，比较多的会存在于一些菊科类的植物当中。菊粉的生产量很高,而且很耐贫瘠,并且它的价格比较低廉^[3]。

而菊粉酶，它一种水解酶，这种水解酶能够用来催化菊粉水解，主要作用于β-2,1-呋喃果糖苷键，从而对菊粉的利用有很大的帮助。菊粉酶的来源来源范围很广，一般情况下是在微生物中会出现的多^[3]。同时，菊粉酶具有很多的应用空间，它可以用来筛选酶活较高的，同时比较稳定的菌株，另外它也可以用来进行诱变育种，从而获得我们所需要的高产突变株,和去阻遏的突变菌株。在酶学性质方面，可以用于研究产酶发酵的条件，通过克隆这一手段来得到高效表达菊粉酶基因,从而构建工程菌。

1.2 γ-聚谷氨酸的概述

1.2.1 γ-聚谷氨酸的结构特点

γ-聚谷氨酸，它是一种高分子氨基酸聚合物，这种氨基酸聚合物是通过 γ-酰胺键使 L-谷氨酸、D-谷氨酸结合而生成的^[2]，它的结构式如下图：