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一种由量子点标记适配体和氧化石墨烯组成的荧光探测器，用于测定脂多糖内毒素

摘要

内毒素是一种复杂的脂多糖(LPS)，是革兰氏阴性菌外细胞膜的关键成分。作者报道了一种荧光探针法测定革兰氏阴性菌的脂多糖。用CdSe/ZnS量子点荧光标记抗LPS的适体，加入氧化石墨烯(GO)后其荧光发射被淬灭。当添加LPS时，适配体与LPS结合并释放氧化石墨烯。这导致荧光的恢复，通常在激发/发射波长495/543 nm处被测量到。探测器对10-500 ng mL^-1浓度范围内的LPS有反应，检出限为8.7 ng mL^-1。该方法可用于在有生物干扰的情况下，对不同革兰氏阴性菌的脂多糖进行选择性检测。

关键词：生物传感器 革兰氏阴性菌 DNA 荧光淬灭 共振能量转移 CdSe/ZnS量子点 荧光启动 受体

简介

脂多糖(LPS)是食品和药品中的重要污染物，其含量是世界各国食品药品监督管理部门严格控制的指标。因此，LPS的检测在制药质量控制、医疗保健和食品工业中受到了极大的关注^[1,2]。

亮点

1.将QDs标记的适配体与氧化石墨烯结合构建荧光探测器。

2.GO- aptmer - qd探测器可以识别并与LPS结合，释放氧化石墨烯，恢复荧光。

3.所构建的探针能灵敏地检测出低LOD 8.7 ng mL^-1 注射剂中的脂多糖。

酶解鲎试剂( LAL)^[3-5]是目前常用的检测LPS的方法。然而，由于其对pH值和温度的依赖性，重复性较低，以及过量采血导致大量马蹄蟹死亡，这些都是LAL检测的主要局限性^[6,7]。

许多无酶检测LPS的方法已经被开发出来，其中基于生物传感器的LPS分析由于其高灵敏度和简单的实验程序^[7]而受到更多的关注。按其转导形式可分为两大类：电化学检测和光学检测。电化学传感具有灵敏度极高的优点^[8-11]，如果结合适体探测器和金原子簇修饰金电极，LPS的检出限可低至7.94 times; 10^-21 M^[9]。

光学LPS生物传感器通常基于荧光和表面等离子体共振(SPR)的测量。基于SPR，银纳米颗粒(AgNPs)-多粘菌素B (PMB)胶态体系^[12，13]用于检测尿液和中药注射剂中的脂多糖。基于荧光的LPS传感器主要用于合成荧光标记的配体，这些配体可以区分和结合LPS。荧光共振能量转移(FRET)是一种灵敏的探测读出器，LPS结合在探针上引起构象改变，导致荧光恢复。在离子对相互作用的基础上，合成了肽功能化的聚二乙炔脂质体^[14]和四苯乙烯^[15]作为LPS的荧光激发传感器。配体结合适配体和基于肽段的LPS荧光传感器具有更强的强健性和特异性。利用来自CD14^[16]的LPS结合域的多肽构建了检测限为20 mu;g mL^-1 的FRET传感器。氧化石墨烯(GO)具有较高的荧光猝灭效率^[17]。当用于生物分子检测的荧光探针时，染料标记的配体通过pi;-pi;叠加相互作用组装在表面上，靶标与配体的偶联使氧化石墨烯的释放诱导荧光恢复。四甲基罗丹明标记肽组装氧化石墨烯(GO)荧光启动传感器^[18]使LPS的检测限降低到1.3 ng mL^-1。Zhang等人合成了6-羧基- X -罗明标记的LPS适配体结合氧化石墨烯检测饮料样品中的LPS，其检测限为15.7ng mL^-1。

与有机染料相比，量子点具有光漂白阈值高、化学稳定性好、光谱性质可调等优点^[20]。QD-GO荧光猝灭系统具有较高的灵敏度和重现性，广泛应用于蛋白质^[21]、核酸^[22]、细菌^[23]、黄曲霉毒素B^[24]等生物分子传感。但是，目前还没有关于QD标记的适配体结合氧化石墨烯检测LPS的报道。

因此，我们提出了第一个QD适体GO荧光探针用于LPS的检测。合成了具有LPS结合域的5rsquo;-NH₂修饰适体，并用量子点标记。结合GO作为荧光猝灭剂，建立了一种灵敏的LPS荧光检测系统。在优化的条件下，对实际样品中的LPS进行了定量检测。为光学LPS的检测提供了一种新的方法。

实验

材料和试剂

LPS适体(NH--CTTCTGCCCGCCTCCTTCCTAG CCGGATCGCGCTGGCCAGATGATATAAAGGGTCAGCCCCCCAGGAGACGAGATAGGCGGACACT-) ^[25] 由上海桑根生物科技有限公司（中国上海）（https://www.sangon.com）合成，高效液相色谱（HPLC）纯化。1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC），N-羟基琥珀酰亚胺（NHS），磷酸盐缓冲盐水（0.01 M，pH 7.4），石墨烯氧化物和LPS从大肠杆菌055：B5，铜绿假单胞菌，和伤寒沙门氏菌购自Sigma-Aldrich（St.Louis, MO, USA）（http://www-sigmaaldrich.com）。水溶性羧基官能团化的CdSe/ZnS量子点的最大发射波长为545plusmn;5 nm，购自武汉佳源量子点有限公司（武汉，中国）（http://www. qds.net .cn）。维生素Bl和0.9%氯化钠注射液购自西南制药有限公司（中国重庆）（hup://www.swp.cn）。所有溶液均由微孔Milli-Q净水系统中电阻率为18.0 M的超纯水制备。所有其他化学品均为分析级，按收到时使用。

采用RF-5301荧光分光光度计(津岛, 日本)（htlps://www.shimadzu.com），150w氙光源，激发光和发射光狭缝宽度为5.0nm。

量子点标记适体的合成

用PBS法制备了1-乙基-3-（3-二甲氨基丙基）-碳二亚胺（EDC）（60 mM）、QDs（1 mu;M）、N-羟基磺基琥珀酰亚胺（NHS）（30 mM）和胺修饰适体（25 mu;M）的溶液。将80 mu;L EDC和80 mu;L QDs溶液混合，并在25℃下在摇床上搅拌。15min后，加入80 mu;L NHS，搅拌20min，再加入18 mu;L 10 mM 三氯苯缓冲液，搅拌2 h，终止QDs表面未反应的羧基。

收集QDs适体结合物，以12000转/分的速率用PBS洗涤3次，15分钟，以完全去除游离适体。将QD适体悬浮于8 mL浓度为0.8 M的PBS（pH 7.4）中。

QD适体GO探针对LPS作用的荧光恢复

将LPS溶于8.5, 10, 50, 100, 200, 300, 400, 500和1000 ng mL^-1的超纯水中。使用前，将LPS储备溶液旋涡并摇动至42°C，以避免形成胶束/聚集体。

将500 mu;L QD -Apt溶液（0.8 mu;M）添加到200 mu;L GO（100 mu;g mL^-1）溶液中并培养30分钟。然后添加200 mu;L LPS溶液（200 mu;g mL^-1）并培养。然后，在25℃下，记录了LPS加入前后不同培养时间下激发/发射波长=495/543 nm的荧光强度。

PBS与维生素B1注射液中LPS的检测

将500 mu;L QD-Apt溶液与200 mu;L GO（100 mu;g mL^-1）溶液混合，并将混合物培养30分钟。然后加入200 mu;L不同浓度的LPS溶液500-8.5 ng mL^-1，再培养30分钟。通过荧光强度比F/F₀与LPS浓度的关系绘制校准图，其中F和F₀分别表示有LPS和无LPS时=495/543 nm处的荧光强度。

取市售维生素Bl注射液（C₁₂H₁₇ClN₄OSHCl 50 mg mL^-1）进行实际样品分析。维生素Bl无菌溶液，pH值2.5-4.0。维生素Bl注射液用PBS（0.01 M，pH 7.4）稀释10倍，然后将其加入到浓度为50, 50, 300, 500和1000 ng mL^-1的400 mu;L LPS标准溶液中，定容为2 mL，得到浓度分别为10, 30, 60, 100和200ng mL^-1的加标溶液。取200 mu;L加标液进行LPS检测，方法与PBS中LPS的检测方法相同。通过标定曲线计算LPS浓度、峰电位恢复率和相对标准差。

结果和讨论

材料的选择

我们小组长期以来一直致力于病原菌的检测。我们设计了用于大肠杆菌检测的电化学阻抗生物传感器PDDA/AuNP@Ag^[26]和Man/MUA-MH/Au^[27]，以及用于鼠伤寒沙门菌检测的荧光生物传感器CdSc/ZnS-QD-lgG抗体^[28]和碳点（CDs）-适体^[29]。结果表明，基于适体的荧光传感器具有与抗体传感器相似的特异性，但其制备过程简单。因此，我们现在要设计一种基于QD标记适体的LPS荧光探针，它不同于我们以前的方法CD适体。我们还想引入一个荧光受体来构建一个更敏感的基于FRET的系统。GO具有很高的荧光淬灭效率，通过与碱基的疏水性和pi;-pi;堆积作用对单链DNA有很强的吸附作用，但对双链DNA或二级和三级结构DNA的亲和力较低。因此，我们设计了QD-Apt-GO荧光LPS探针，CdSe/ZnS QDs、适体和GO分别为荧光供体、LPS识别配体和荧光淬灭剂。

量子点DQ-Apt-GO荧光探针的机理

LPS QD-Apt-GO荧光探针的原理如图一所示。合成了具有LPS结合域的氨基修饰单链DNA，并用量子点在N端标记。具有单链构象的量子点适体配合物在溶液中通过pi;-pi;堆积随机吸附到物理上，QD-Apt与GO之间的距离小于10 nm，通过FRET导致荧光淬灭（图1）。加入LPS后，LPS通过范德华力、碱基堆积作用、氢键或静电作用识别并结合单链核酸适体，形成折叠良好的QD-Apt-LPS复合物。适配子嘌呤和嘧啶碱基的占据使QD-Apt和GO之间的相互作用减弱。这导致GO和荧光恢复的重新激活（图1）。加入200 ng mL^-1 LPS后，543 nm处的荧光强度在培养30min后增加20倍（图2）。表示QD-Apt-GO探针对LPS浓度变化敏感。该荧光淬灭系统在激发波长495 nm处显示荧光光谱在500～600 nm范围内，最大发射波长为543 nm（图2）。

脂多糖(LPS)检测方法的优化

优化了以下参数：（a）GO用量；（b）QD-Apt与GO的培养时间；（c）QD-Apt-GO与LPS的培养时间；（d）样品pH值。电子支撑材料中给出了相应的数据和图形（图Sl-图S4）。实验结果表明：（a）100 mu;g mL^-1 GO；（b）QD-Apt与GO的培养时间为30min；（c）QD-Apt-GO与LPS的培养时间为30min；（d）最佳样品pH值为7.0-8.0。Stern-Volmer图（图S2）显示了0-100 mu;g mL^-1范围内的向上曲线形状，这是动态淬灭和静态淬灭结合的特征。

图1量子点QD-Apt-GO荧光探针的机理

QD-Apt-GO对脂多糖(LPS)的选择性和特异性

LAL是LPS的主要检测方法，但其操作条件苛刻，易受beta;-D-葡萄糖或Zn² 、Mg² 、EDTA等离子干扰，导致假阴性结果。此外，对于药物注射剂，活性成分通常以含有Cl^-、PO₄^3-和Na 等离子的盐存在。为了研究QD-Apt-GO荧光探针的选择性，研究了EDTA（对LAL的影响），研究了Zn² 、Mg² 、H₃PO₄、BSA、DNA和beta;-D-葡萄糖（LPS的功能组）（图3）。值得注意的是，即使在100倍于LPS的浓度下，所有这些干扰因素对荧光强度比F/F₀也没有显著影响（图3黑柱）。相反，在这些干扰剂中加入500 ng mL^-1 LPS溶液后，荧光恢复发生，F/F₀变化至少10倍（图3灰色柱）。

在未经任何预处理的情况下，对0.9% NaCl注射液中的LPS进行了检测。如图3所示，0.9% NaCl注射液的F/F₀变化不大。因此，这种QD-Apt-GO-LPS探针对LPS具有高度的选择性，即使在存在干扰物和真实的药物注射样品中也是如此。

为探讨该QD-Apt-GO探针是否能检测其它革兰氏阴性菌的LPS，将从大肠杆菌、铜绿假单胞菌和伤寒沙门菌中纯化的200 ng mL^-1脂多糖添加到探针溶液中。结

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