双氰胺与盐酸苯肼抑制设施黄瓜土壤硝化反应的最佳施用浓度优化
2023-11-09 09:11
论文总字数：15535字
摘 要
本文以设施黄瓜土壤为研究对象，采用正交设计的方法，通过检测土壤中铵态氮的硝化速率，优化双氰胺与盐酸苯肼两种硝化抑制剂的不同配施浓度。实验结果表明，在实验影响因素中，双氰胺的影响大于盐酸苯肼，其中，以10μmol/g双氰胺与5μmol/g的盐酸苯肼配施时，设施黄瓜土壤氮肥转化效率最低。关键词: 设施黄瓜土壤，硝化抑制剂，硝化速率，正交实验
Abstract: In this paper, the method of orthogonal design is used to study the soil of the facility cucumber. By detecting the nitrification rate of ammonium nitrogen in the soil, the combined application concentration of dicyandiamide and phenylhydrazine hydrochloride, the two kinds of nitrification inhibitors was optimized. The experimental results showed that the effect of dicyandiamide was greater than that of phenylhydrazine hydrochloride. Among them, the conversion efficiency of soil nitrogen fertilizer was the lowest in the facility cucumber soils with 10μmol/gdicyandiamide and 5μmol/g hydrochloride.
Keywords: facility cucumber soils, nitrification inhibitors, rate of nitrification, orthogonal experiment
目 录
1 前言 4
1.1 研究背景和意义 4
1.2 国内外研究进展 5
1.3 硝化抑制剂定义及种类 6
1.4 硝化抑制剂作用机理 7
1.5 硝化抑制剂应用效果 8
1.5.1 对土壤和环境质量的影响 8
1.5.2 作物产量和品质的影响 8
2 材料和方法 9
2.1 材料、试剂与仪器 9
2.2 实验方法 9
2.2.1 正交设计 9
2.2.2 土样的采集与培养 9
2.2.3 土壤铵态氮的检测 10
3 结果与分析 11
3.1 设施黄瓜土壤硝化反应的最佳施用浓度优化 11
3.2 土壤硝化速率比较 12
结 论 14
致 谢 19
1 前言
在农业生产中，为了进一步提高农作物的产量，人们在不断扩大设施蔬菜栽培面积，并大量使用氮素。研究表明，以高硝化反应为特征的设施农业生产导致大量的氮肥流失。虽然氮肥在设施蔬菜中的施用量大大超过蔬菜正常吸收利用量，但蔬菜对于氮肥的吸收利用量少，这样不仅造成资源浪费，还加重环境负担。为了解决当前设施农业氮肥流失问题，研究发现，硝化抑制剂可以降低氮肥转化、减少N2O的排放、减少硝态氮淋失等[1-4]。但是由于处于不同地区的土壤的性质存在显著的差异，因此，对于不同的设施土壤，施入最佳浓度的硝化抑制剂也不同。研究表明，现在硝化抑制剂中的双氰胺（DCD）在世界各国应用最多，双氰胺有许多优点：挥发性不强，施用后在土壤中的残留量不高，对环境不造成太大的影响，物化性质相对稳定，硝化抑制效果好。但盐酸苯肼（PHH）作为硝化抑制剂，目前国内外研究较少，在农业中的应用也是鲜有出现。为了抑制设施土壤氮肥硝化速率，减轻氮肥流失造成的环境污染，研究设施蔬菜土壤的硝化抑制剂最佳施用量已成为了农业生产中亟待解决的问题。本文通过在设施黄瓜土壤中分别配施不同浓度的双氰胺（DCD）和盐酸苯肼（PHH）进行实验，评价不同处理组的铵态氮在土壤中的存留情况，确定硝化抑制剂在设施黄瓜土壤中的最佳配施浓度，为降低氮肥损失和缓解环境污染提供依据。
1.1 研究背景和意义
设施蔬菜栽培是通过调节蔬菜全部或部分的生长阶段所需的温度、光照、水分、肥料、空气等，充分满足蔬菜生长需要，使种植的蔬菜质量满足人类需求和产量得到提高的一种生产方式[5]。
我国设施园艺种植大国，设施园艺种植面积处于世界前列。其中，设施园艺中的设施蔬菜占有较大比重[6]，种植面积仍不断扩大，预计到2031年，设施蔬菜面积会超过到200万hm2[7]。氮肥是增加设施蔬菜产量的最重要养分限制因子，同时，氮肥中的氮素也是蔬菜的必需营养元素，在提高设施蔬菜的产量和品质等方面有着重要的作用。但为了不断提高设施蔬菜产量，人们一直盲目的过量施用氮肥，我国设施大棚土壤氮肥一直处于过量状态，破坏了土壤的成分和结构。这样的情况使我国的设施蔬菜土壤对氮肥的依赖性不断增大，导致氮肥施入量也在不断增加，目前我国氮肥施用量居世界首位。研究表明，设施蔬菜过量施肥现象明显，施肥量超过蔬菜正常需要量的3-5倍，甚至10倍以上。据统计，绝大多数的国家粮食增产的原因是源于大量氮肥的施用。
氮肥的过量施用和在土壤中快速转化，导致氮肥利用率普遍较低，以硝酸盐和气态形式的损失达67.3%~94.7%[8]。在设施蔬菜栽培中，为了提高设施蔬菜作物产量和生长速度，农民会过量施入氮肥，给蔬菜大量且频繁地灌水，因此，硝态氮会进入土壤深层或通过淋失和径流会进入水体，土壤中过高硝态氮破坏了土壤成分和结构，水体中过高硝态氮破坏了水生生态系统的平衡。张丽娟等研究发现，在土壤中过量施入氮肥，导致设施蔬菜土壤氮肥大量积累，氮素在硝化作用下转化为硝态氮，由于大棚蔬菜的灌溉量大，通过淋失进入水体的氮对地下水造成一定的污染[9]。
设施土壤氮肥的大量使用使氨的挥发量也逐渐增多，降低氮肥的利用效率。此外，土壤中的氮素通过硝化和反硝化作用产生N2O，也会造成氮素的损失。大量的N2O排放到大气中后会加重温室效应。研究表明，1molN2O的增温效应大约是CO2的150-200倍，是CH4的12倍[10]。
氮肥的过量施用和利用率低下的问题给不仅给人们带来一定的经济负担，还给环境带来的负面影响。据统计，我国每年因氮肥损失人民币达到360亿元。如果提高1%的氮肥利用率，全球每年在肥料花费上至少可以节约234，000，000美元[11]。
长期以来，人们只重视施氮肥的产量效应，忽视了其给环境带来的负面影响，因此积极开展设施蔬菜氮肥与硝化抑制剂合理配施，提高氮肥利用率，实现设施蔬菜高产、优质、安全是目前生态农业中亟待解决的一个问题。
1.2 国内外研究进展
为了使设施蔬菜生产可持续发展，人们需要解决设施土壤氮肥利用率低的问题，减轻因其损失对环境造成的负面影响，最终实现设施蔬菜高产、高效、安全。
目前，设施土壤氮肥利用率低及造成的环境污染等问题引起人们的关注，研究发现，硝化抑制剂通过抑制土壤中硝化细菌的活性来抑制土壤中氮肥转化，使施入氮肥能以铵态氮的形态较长时间存留在于土壤中供蔬菜利用，而且通常情况下，其硝化抑制剂对动物及环境没有负面影响[12-13]。
硝化抑制剂的合理配施可以抑制设施土壤氮肥转化，这种特性使硝化抑制剂逐步应用到设施蔬菜生产中，其在提高氮肥利用率，减轻环境污染等方面有积极影响[14]。目前，研究者发现并合成许多具有硝化抑制作用的产品，但不同的硝化抑制剂及其不同的浓度的配施对于不同土壤铵态氮转化效果的影响也不同，但现在国内对于这方面的研究还相对较少。另外，研究者对于硝化抑制剂种类的选择及其最佳浓度的筛选没有考虑到土壤之间存在的差异，没有考虑到硝化抑制剂施用的植物种类以及它的施用给经济、社会和环境带来的影响。
1.3 硝化抑制剂定义及种类
硝化抑制剂是能够抑制土壤中硝化细菌等微生物活性的物质，其能够抑制硝化过程反应过程中任意一步或几步反应。在通常情况下，首先在亚硝化细菌的作用下，将土壤中的铵根（NH4 ）会快速地转化为亚硝酸（NO2-）；然后再在硝化细菌的作用下转化为硝酸根（NO3-），硝态氮容易流失进入水体[15]。
硝化抑制剂的研究开始于19世纪50年代，国际上很早就对硝化抑制剂进行筛选和研究[16]。要确定一种物质是否可以作为硝化抑制剂，必须经过大量的室内和田间试验来验证，一是要能够抑制NH4 向 NO3-氧化，二是要安全有效，成本低廉，使用方便等特点。首先对人工硝化抑制剂展开研究的是美国，后来各个国家包括我国也开始研究。目前，国内外常用的几种硝化抑制剂主要有氰胺类化合物、乙炔、3,4-二甲基吡唑磷酸盐、2-氯-6-（三氯甲基)吡啶等，具有价格低廉，安全方便，环境友好的特点[17]。在农业生产活动中，对于农作物减施增效具有显著成效。
- 双氰胺简称为DCD，是氰胺类硝化抑制剂[18]，无毒，其物理和化学性质稳定，由于抑制铵态氮转化效果明显，经济实用，应用广泛。DCD的作用机理主要是抑制硝化反应中NH4 氧化为NO2-的过程。DCD硝化抑制效果明显，能够显著抑制土壤中氨态氮的转化。研究发现[19]，在土壤中施入50mg/kg的DCD对抑制不同土壤中的硝化细菌的数量效果能显著。在温度低于15℃条件下，明显降低了铵态氮的转化，土壤中铵态氮可以保持较长时间。DCD不仅有抑制硝化作用特性，还可以作为一种缓释肥料，最终分解的产物也不会给环境带来负面影响。
2、乙炔（C2H2）是一种常见的气态硝化抑制剂，效率很高。我国对乙炔的研究较少，而国外对乙炔的研究较多。研究发现，0.1帕的乙炔可造成显著的硝化抑制，抑制现象明显，10帕的乙炔则可完全抑制铵态氮的转化，102~104帕的乙炔也可抑制硝化作用[20]。从物理性质上看，乙炔是一种气体。因此，乙炔能容易地扩散到土壤的空隙中，在农业应用中更加快捷方便。另外，将乙炔应用在抑制铵态氮的实验过程中，实验花费的时间相对较短，在实验中不需添加其他物质；但作为硝化抑制剂它也有缺点，由于乙炔一种气体，不能在一段时间内土壤中维持较高的浓度来抑制铵态氮态氮的转化[21]。为了解决乙炔在应用时的缺点，研究者发现使用包被碳化钙可以使乙炔能够缓慢地从中释放出来。
3、3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）在土壤中几乎不发生迁移，不易发生与NH4 分离现象和淋溶问题，通常与氮肥同时施用，其毒性低，不会对作物和环境带来危害。研究表明，在田间土壤中施加DMPP施用量为0.5~1.5kg/hm2时，可以使土壤中铵态氮在田间保存长达1-3个月，当DMPP在土壤中分布均匀时，0.39ug/g DMPP表现出硝化抑制效果显著[22]。DMPP对于作物提高产量有一定的作用，研究发现，1.8kg/hm2的DMPP对于油菜和水稻产量有一定的提高。但它和其他硝化抑制剂一样，DMPP也会受到其他因素的影响，Barth等采用多元回归分析发现[23]，DMPP抑制土壤铵态氮转化会受到土壤理化性质和土壤相关酶的活性等因素影响。
4、2-氯-6-（三氯甲基）吡啶，难溶于水，美国化学公司利用其抑制铵态氮转化的特性生产了N-serve抑制剂。在美国，每年大量的农田使用N-serve抑制剂产品，尤其是玉米种植区，玉米增产效果明显[24]。大量研究报道，2-氯-6-（三氯甲基）吡啶可以抑制土壤中的硝化菌，并降低硝化菌的活性，甚至还可以将其消灭。因此，2-氯-6-（三氯甲基）吡啶既可以减少氮素流失和抑制N2O的释放，又可以提高农作物的产量和品质[25]。但2-氯-6-（三氯甲基）吡啶的挥发性将强，且容易在阳光照射下分解，会产生较高的蒸汽压，不适合表施和储存[26]。2-氯-6-（三氯甲基）吡啶与其他硝化抑制剂一样，会受到土壤温度、水分、营养元素等因素的影响，并且2-氯-6-（三氯甲基）吡啶是有机氯化合物，大量施用会对作物和环境造成负面影响。
1.4 硝化抑制剂作用机理
在土壤施入氮肥后，通过土壤中硝化细菌等微生物的作用使土壤中的铵态氮向硝态氮转化。硝化反应为亚硝化反应和硝化反应两个步骤。第一个步骤是在亚硝化细菌作用下将NH4 氧化为NO2-，这个过程中的中间产物分别是NH2OH 和H2N2O2，H2N2O2分解会产生N2O和H2O。第二个步骤是在硝化细菌作用下将NO2-氧化为NO3-。土壤的硝化作用反应式表示如下[27]：
NH4 NH2OH (e.g. H2N2O2) NO2- NO3-
N2O H2O
在土壤中施入硝化抑制剂后，其可以通过抑制两个步骤中的任意一个步骤来阻止整个硝化反应的进行，阻碍土壤中铵态氮转化成硝态氮。目前已经发现和合成多种硝化抑制剂，但硝化抑制剂作用机理没有较大差异，硝化抑制剂通过抑制硝化菌等微生物的硝化活性抑制硝化作用，其中，大多数的硝化抑制剂会抑制硝化反应的亚硝化细菌。其中，还有一类硝化抑制剂（乙炔、双氰胺等）不仅对硝化过程进行抑制，还能抑制反硝化作用，反硝化作用反应式如下：
NO3- NO2- NO N2O N2
氮肥施入土壤后，在硝化抑制剂的阻碍作用下，土壤中能较长时间保持NH4 -N较高水平和NO3--N较低水平，不仅提高作物的氮肥利用效率，还减少硝态氮的淋失和N2O的释放，促进农业生态的可持续发展。
1.5 硝化抑制剂应用效果
1.5.1 对土壤和环境质量的影响
目前，为了提高设施蔬菜的产量，人们对设施土壤施入较高含量的氮肥，造成耕层土壤长期积累大量盐分。在设施蔬菜大棚中，人们提高设施大棚的温度和湿度，这样有助于加快蔬菜生长速度和提高蔬菜产量，但高温高湿的环境也提高了设施土壤中硝化细菌的活性，加快设施土壤NH4 -N转化为NO3--N，增加了设施土壤中的NO3--N含量，造成设施土壤酸化和次生盐渍化[28]。硝化抑制剂的施入使设施土壤有明显的改善，不仅可以改善作物的铵营养，还能促进作物对土壤中K 、Ca2 、Mg2 等阳离子、土壤磷酸盐和微量营养元素的吸收利用。硝化抑制剂能抑制土壤中铵态氮向硝态氮转化，使土壤中的铵态氮含量能较长时间存留在土壤中，降低了硝酸盐的淋溶损失量，保护了土壤成分和结构[29]。孙志梅等采用室内试验发现，DMPP能明显抑制土壤中铵态氮的转化；在土壤中配施DCD可明显减少铵态氮向深层土壤中淋溶，可减少淋溶达到70%[30]。有研究表明，DCD的施用可使农田和奶牛场的土壤氮肥淋失量减少，通过淋溶损失的氮肥由40.6%，降低到9.8%~10%[31]。
设施大棚高温高湿的环境提高铵态氮硝化效率的同时，还会产生大量的N2O。在设施大棚中施入硝化抑制剂可减少N2O的排放，减轻其对环境造成的负面影响。Weiske等3年实验证明，DCD的施用可显著减少土壤中N2O排放，缓解大气污染。郭建华等研究施用DCD对牧草土壤中铵态氮转化影响，实验发现，N2O在土壤中增施一定浓度的DCD时，N2O的排放量显著降低，高峰期的排放量减少了11倍[32]。Di等试验研究发现，施用DCD对减少牧场N2O气体排放效果显著，在不同季节和不同土壤中施用DCD可使总的N2O气体的排放量有显著降低。周礼恺等[33]通过盆栽试验，研究了DCD对种稻土壤N2O排放的影响，结果表明，在土壤中施DCD对于减少水稻生长期的土壤N2O的排放效果显著。
1.5.2 作物产量和品质的影响
目前设施蔬菜含有大量硝酸盐，在土壤中配施一定浓度的硝化抑制剂可以减少蔬菜中硝酸盐的含量，由于硝化抑制剂可以抑制土壤NH4 -N的转化，减少了设施蔬菜对NO3--N的吸收。傅柳松等研究结果发现[34]，在土壤中添加一定浓度的DCD可使青菜叶中硝酸盐含量降低。申丽敏研究发现[35]，在土壤中添加DCD不仅对提高油菜产量有显著效果，其增产幅度23%~34%，还对蔬菜硝酸盐的积累有抑制作用，硝酸盐含量降低15%~31%，提高了蔬菜的品质。有研究发现，硝化抑制剂的施用对不同作物品质和产量的影响存在较大差异，另外由于土壤中铵态氮的抑制效果也会受到多种因素的影响，导致硝化抑制剂的施用可能对作物有积极影响，也可能对作物影响不大。有研究发现，在土壤中施用一定浓度的DCD后，莴苣、菠菜、小白菜硝酸盐含量降低24％、18％~61％、44.1％。有研究表明[36]，在粗质地的土壤上和在细质地土壤中施入双氰胺和2-氯-6-（三氯甲基）吡啶在提高小麦、玉米和马铃薯产量上差异很大，前者能有效提高作物产量，而后者对作物产量影响不大。
2 材料和方法
2.1 材料、试剂与仪器
材料：设施黄瓜土壤；
试剂：铵态氮标准液；硫酸钾；硫酸铵；双氰胺（DCD）；盐酸苯肼（PHH）；Na3PO4.12H2O；EDTA；Na3C6H5O.2H2O；次氯酸钠；苯酚；亚硝基铁氰化钠；NaOH。
仪器：锥形瓶，试管架，移液枪，96孔板，离心管，恒温培养箱，分光光度计，摇床，涡旋仪，离心机。
铵态氮检测相关试剂：试剂①：将3gNa3PO4.12H2O ，3gNa3C6H5O.2H2O ，0.3gEDTA溶解于蒸馏水，定容至100ml，冷藏保存；试剂②：将1.2g苯酚及4mg亚硝基铁氰化钠溶解于18.8 ml试剂①中，冷藏保存；试剂③：0.18 ml（0.12ml）次氯酸钠与1.2 ml 2MNaOH 溶液混合后，加入4.72ml蒸馏水，现配现用。
2.2 实验方法
2.2.1 正交设计
采用L9（32）正交试验表安排试验，对各组设施黄瓜土壤进行处理，具体因素水平(见表1)。以DCD（A）为考察因素，设置1μmol/g ，5μmol/g，10μmol/g三个不同水平，以PHH（B）为考察因素，设置1μmol/g ，5μmol/g，10μmol/g三个不同水平，两个变量分为9组（见表2），每组设3个重复。
2.2.2 土样的采集与培养
1、供试土壤为淮安设施黄瓜的土壤，取5-10cm的浅层耕作土壤，去除土壤中较大的石块和一些杂草，过2mm筛，风干备用；
2、按照正交设计，实验共设9个处理，在100ml三角瓶中分别加入20g土壤和0.1ml的2mol/L硫酸铵，使土壤中的铵态氮的浓度达到0.56g/L；
3、按试验设计将DCD和PHH用量处理均在培养试验开始前溶于水后混合均匀后一次性施入，每个处理设3次重复，与土壤充分混匀装入有盖的培养瓶中，培养瓶盖上有两个直径为0.5cm的交换气孔，用于气体交换；
4、装瓶后加入蒸馏水调节土壤含水量为田间最大持水量（田间持水量：50%），置于25℃的培养箱中培养12d。
5、培养试验开始后，分别在0d和12d采集土样，检测土壤NH4 -N含量，在培养期间按期称重，并补加蒸馏水以保持土壤含水量一致。
2.2.3 土壤铵态氮的检测
1、称取2g培养的设施黄瓜土壤，加入10ml 0.5MKCl120rpm 震荡30min；
2、吸取土壤悬浊液，转入1.5ml离心管中，放入离心机以1200rpm离心10min，上清液转入另一干净的离心管中，-20℃保存备用；
3、吸取上清液10μl，蒸馏水定溶于1000μl；
4、将10mM标准液用蒸馏水定溶于1000μl，获得各浓度标准液吸取上述溶液50μl转入96 孔检测板；
5、加入30μl试剂③；
6、加入20μl试剂②；
7、室温黑暗放置1hr以上，在吸光值为635nm下检测NH4 -N的含量。
8、计算：用excel表格对铵态氮含量与吸光度作标准曲线，计算土壤铵态氮含量（N，μg/g）用excel对标准曲线拟合出线性方程公式：
y=k*x b
其中，x为吸光值；y为铵态氮的含量；k为斜率；b为截距。由excel给出的方程的r2gt;0.9990，说明该方程线性关系好。计算实验组铵态氮含量，并使用DPS7.05 分析软件进行数据统计分析。
表1 因素水平表
水平 | 因素 | |
A | B | |
1 | 1 | 1 |
2 | 5 | 5 |
3 | 10 | 10 |
表2 各实验组处理方案
处理号 | A | B | A*B |
1 | 1 | 1 | 1 |
2 | 1 | 2 | 2 |
3 | 1 | 3 | 3 |
4 | 2 | 1 | 2 |
5 | 2 | 2 | 3 |
6 | 2 | 3 | 1 |
7 | 3 | 1 | 3 |
8 | 3 | 2 | 1 |
9 | 3 | 3 | 2 |
3 结果与分析
3.1 设施黄瓜土壤硝化反应的最佳施用浓度优化
表3 正交实验结果
处理号 | A | B | A*B | 空列 | 转化值 |
1 2 3 4 5 6 7 8 9 K1 K2 K3 剩余内容已隐藏，请支付后下载全文，论文总字数：15535字
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