以秸秆为原料生产低聚木糖的发酵条件优化
2023-09-12 08:09
论文总字数：10508字
摘 要
低聚木糖是一种功能性低聚糖，合理利用将会帮我们节约许多资源，对环境的污染也将大幅度减少。秸秆也是我们常见的农业生产资源，而我们对秸秆处理最常使用的方法就是焚烧。而本实验主要通过酶解的方法，使用实验室保藏的酵母菌，以秸秆为原料来生产低聚木糖，本实验低聚木糖的测量主要采用DNS法，实验优化主要采用单因素法先分析适合酵母分解秸秆产生低聚木糖的最佳碳源，氮源和无机盐以及其浓度，再通过正交实验的方法分析得出适合酵母以秸秆为原料生产低聚木糖的最佳的培养基组合。通过实验可以得出最佳的发酵条件是玉米秸秆浓度为30g/L，酵母粉浓度为4g/L，Mg2 浓度为0.4g/L，Fe2 浓度为0.4g/L。关键词：低聚木糖，木聚糖酶，发酵，提取，正交实验 ，单因素分析
Abstract: Xylose Oligosaccharide is a functional oligosaccharides, rational use will help us save a lot of resources, the pollution of the environment will be greatly reduced. Straw is also our common agricultural production resource, and our most commonly used method for straw treatment is incineration. This experiment mainly through the method of enzymatic hydrolysis, the use of laboratory preserved yeast, straw as raw material to produce xylose, the measurement of oligosaccharides mainly using DNS method, experimental optimization mainly using single-factor method to analyze the best carbon source, nitrogen source and inorganic salt and its concentration suitable for yeast decomposition straw production of xylose, By means of orthogonal experiment, the optimum medium combination of oligosaccharide for the production of xylose with straw as raw material was obtained. The optimum fermentation condition is that the concentration of corn straw is 30g/L, and the concentration of yeast powder is 4g/L,Mg2 0.4g/L,Fe2 concentration is 0.4g/L.
Key words: Oligosaccharides, xylanase, fermentation, extraction, orthogonal experiments, single factor analysis
目录
1 前言 6
1.1研究背景 6
1.2低聚木糖简介 6
1.3低聚木糖的提取方法 6
2 实验所需材料以及所采用的方法 7
2.1基本实验材料 7
2.1.1菌种来源 7
2.1.2 PDA固体种子培养基配置 7
2.1.3种子液的制备方法 7
2.1.4发酵液的成分与配置 7
2.1.5试剂配置 8
2.2实验步骤 8
2.2.1菌种活化的步骤 8
2.2.2 种子液的配置步骤 8
2.2.3 DNS法测定低聚木糖含量 8
2.2.4单因素分析法 9
2.2.5正交实验分析法 9
3 实验结果总结 10
3.1单因素分析法所得出的结论 10
3.1.1秸秆的种类和浓度对低聚木糖产量的影响 10
3.1.2氮源及其浓度对低聚木糖产量的影响 12
3.1.3 Mg2 浓度对低聚木糖产量的影响 13
3.1.4不同浓度的Fe2 对低聚木糖产量的影响 14
3.2正交实验结果分析 15
1 前言
1.1研究背景
我国的秸秆资源，每年产量多的同时浪费也非常严重。目前，农民处理农作物秸秆的主要方法就是焚烧，首先焚烧会产生许多烟雾，这不仅降低了空气质量，也对环境造成了巨大的破坏。而且秸秆对于实验来说是极好的材料，秸秆中含有大量的木质素，半纤维素等，这是生产木聚糖的主要原料，而通过一定的方法，我们可以用从秸秆中提取的木聚糖进一步提炼出低聚木糖，低聚木糖作为一种市场价值非常可观的食品添加剂成分，在我们日常生活中由非常广阔的运用。由此可知，对农业副产品秸秆，进行一定的分解，发酵，提炼等操作，会对我们的农业，工业等许多领域都有极大的影响。所以本实验将以秸秆为原料生产低聚木糖，并且对该发酵步骤进行优化，以此达到对秸秆资源的再利用。
1.2低聚木糖简介
低聚木糖作为一种附加值高，市场前景看好的功能性食品添加剂，是目前国内外竞相研究开发的功能性低聚糖之一[1]。低聚木糖又称木寡糖，是由2-7个木糖分子以β-1,4糖苷键结合而成的功能性聚合糖[2]。与通常人们所用的大豆低聚糖，低聚果糖，低聚异麦芽糖等相比具有独特的优势，它可以选择性地促进肠道双歧杆菌的增殖活性[3]。在自然界中，竹笋等天然植物中含有少量的低聚木糖[4]。另外，一部分植物半纤维素在人体大肠中也可以被分解转化成低聚木糖[5]。
1.3低聚木糖的提取方法
如今已有文献报道以玉米芯为原料，采用霉菌深层发酵直接生产低聚木糖[6]。曲酶，毛壳酶，细菌等微生物都能生产低聚木糖，可以根据这些酶的特性来制定不同的发酵方案，选择不同的发酵底物，在一定程度上也可以提高低聚木糖的产量。
本实验是以秸秆为原料生产低聚木糖，秸秆在我国是产量比较多的农作物资源，而且我国目前对秸秆资源的利用率不是太高，所以该实验也可作为秸秆资源利用的一种形式。本文主要研究的内容是，首先运用单因素分析的方法，通过控制变量，首先控制除了碳源以外的其他因素不变，改变碳源的种类，以此来对比得出最佳的碳源，然后一步步优化，逐步确定最佳的碳源浓度，最佳的氮源及其浓度等等。等到培养基的最佳成分都确定之后，再通过正交实验的方法，来最终确定这些成分的配比，以及这些成分对酵母菌生产低聚木糖的影响程度。
2 实验所需材料以及所采用的方法
2.1基本实验材料
2.1.1菌种来源
实验所使用的菌种是淮师生科院实验室所保存的马克斯克鲁维酵母菌株[7]。
2.1.2 PDA固体种子培养基配置
配制方法：将新鲜的土豆洗干净并且去皮，称取40g，在200ml的蒸馏水中煮沸，直到土豆可以被戳烂为止。在烧杯上铺上两层纱布，把煮好的土豆晾凉后，连同煮土豆的水一起到在纱布上进行过滤。取滤液，在滤液中加入4g葡萄糖和4g琼脂，边加入边搅拌，待其全部溶剂热后，再将溶液定容至200ml。定容完成后，可将溶液倒入250ml培养基中，进行包扎。
由于本实验要在无菌条件下进行，所以培养基密封包扎完成后，就要用高压蒸汽灭菌锅对其进行灭菌，以此来保证无菌条件的。由于培养基中有琼脂，为了防止培养基凝固，可在培养基稍微冷却后，在无菌操作台上倒平板[7]。
2.1.3种子液的制备方法
YPD培养基：取酵母粉1.5g，蛋白胨3g，葡糖糖3g，玻璃棒搅拌，使其完全溶解于150ml蒸馏水中[8]。将配置好的溶液倒入250ml锥形瓶中，并将锥形瓶密封包扎。将包扎好的锥形瓶放入高压蒸汽灭菌锅中，121℃高温下灭菌20min[8]，在无菌操作台上，将0.5ml酵母菌移入灭完菌并已完全冷却的种子液培养基中，进行培养。
2.1.4发酵液的成分与配置
基本发酵培养基中提供碳源的成分有玉米秸秆，葡萄糖，葡萄糖主要起到了辅助碳源的作用。作为氮源的成分是（NH4）2SO4。除了碳源氮源，无机盐也是培养基必不可少的成分，本实验采用的无机盐主要有KH2PO4，MgSO4，其中KH2PO4 主要起到调节PH值得作用。保持溶液在配置完成后原有的ph不改变[9] ，将配置好的培养基进行高压蒸汽灭菌。
2.1.5试剂配置
1．DNS试剂的配制：
称取182g酒石酸钾钠，于装有500ml纯水的烧杯中加热溶解，按顺序加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21g，苯酚5g，并进行搅拌以加速其溶解[10]。待溶液冷却至室温后，加入蒸馏水定容到1000ml，并且避光保存，该试剂至少需要置于室温下一个星期之后，才可以进行使用[11]。
2．低聚木糖标准溶液的配制
将无水低聚木糖置于80℃下烘干，直到重量不发生变化后，称0.1g烘干后的低聚木糖置于烧杯中，并用蒸馏水溶解，转至100ml容量瓶中定容，得到1mg/ml低聚糖标准溶液，备用[12]。
3．实验过程中所需要的原料和试剂
秸秆（玉米，水稻，小麦），KH2PO4，葡萄糖，Fe2SO4•7H2O，蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，（NH4）2SO4，尿素，酵母粉，MgSO4。
2.2实验步骤
2.2.1菌种活化的步骤
由于本实验需要在无菌的环境下进行，所以先将无菌操作台的紫外光打开，灭菌30min，待灭完菌后，将我们之前倒好的PDA平板和实验室保藏的酵母菌一起放入无菌操作台上，进行平板划线操作。将划完线的平板放到恒温培养箱中培养3天。这次培养出来的酵母菌即活化的酵母菌，可用于以后的种子液的制备。
2.2.2 种子液的配置步骤
种子液的配置过程也需要无菌操作，所以实验开始之前还是需要先对无菌操作台进行30min的紫外灭菌，然后在灭完菌的操作台上，从用于菌种活化的培养皿上刮取适量酵母菌到装有100mlYDP的培养基中，振荡使菌种与YDP溶液均匀混合，然后将混合后的培养基密封包扎，放到摇床上培养2天，培养完成的溶液即为酵母菌的种子液。
2.2.3 DNS法测定低聚木糖含量
1.绘制低聚木糖的标准曲线
①取出六根试管，并且依次做上标记
②按照标记分别向试管中添加0ml，0.2ml……1ml六个梯度含量的低聚木糖
③加完低聚木糖溶液后，再用蒸馏水分别将六根试管定容至2ml[13]
④接着按照溶液：DNS试剂=1:1的比例，分别向试管中加入DNS试剂
⑤将配置好的溶液沸水浴10min
⑥沸水浴完成后，取出试管并冷却至室温后，将试管中的溶液于540nm的波长处测定吸光度值[14]
⑦最后根据吸光度值，画出标准曲线（见图2.1），算出回归方程为Y=0.8679X-0.0717。
2.实验过程中酵母菌低聚木糖的产量的测定
⑴首先打开超净台紫外灭菌30min，然后取出离心管做上标记。取出2ml已经培养好的发酵液，放入相对应标记的离心管中，离心10min，离心机设置为5000r/min。
⑵离心完成后，吸取1ml上清液稀释30倍。
⑶取出2ml被稀释30倍的上清液，向其中加入2ml的DNS溶液，轻轻晃动，使溶液混合均匀。
⑷溶液混合均匀后，放入水浴锅中进行沸水浴。
⑸将加热好的溶液先冷却，然后测定溶液在波长为540nm处的吸光度值。
⑹根据测定的吸光值，再结合之前测定的低聚木糖的回归方程算出发酵液中酵母菌低聚木糖的产量。
2.2.4单因素分析法
首先保持发酵培养的外在条件不变，单独改变发酵培养基的某一特定成分，从而对碳源，氮源，无机盐进行探究[15]，根据测得的吸光度值和低聚木糖标准曲线，算出发酵液中低聚木糖的含量，从而得出最优的碳源，氮源，镁离子浓度和亚铁离子浓度。
2.2.5正交实验分析法
由单因素实验分析法可知，最佳的碳源是玉米秸秆，最佳的碳源浓度是40g/L；最佳的氮源是酵母粉，最佳的氮源浓度是3g/L；最佳的镁离子浓度是0.4g/L，最佳的亚铁离子浓度是0.3g/L。为了进一步确定最佳的发酵液培养基组合，根据单因素分析法得出的最佳成分，最终确定了玉米秸秆，酵母粉，镁离子，亚铁离子四个因素；根据单因素法得出的各个成分的最适浓度，为每个因素制定了三个水平，最终得出了如表2.1所示的因素水平表。
表2.1因素水平表
序号 | 玉米秸秆 | 酵母粉 | Mg2 浓度 | Fe2 浓度 |
1 | 30g/L | 2g/L | 0.3g/L | 0.2g/L |
2 | 40g/L | 3g/L | 0.4g/L | 0.3g/L |
3 | 50g/L | 4g/L | 0.5g/L | 0.4g/L |
图2.1低聚木糖含量标准曲线
3 实验结果总结
3.1单因素分析法所得出的结论
3.1.1秸秆的种类和浓度对低聚木糖产量的影响
小麦秸秆，玉米秸秆和水稻秸秆中都含有大量蛋白质，半纤维素，纤维素，维生素等营养物质，是微生物生长良好的碳源[16]。而且这些物质，都可通过酵母菌的分解产生低聚木糖，所以选取这三种秸秆作为本次实验最佳碳源的研究对象。
在实验过程中，控制培养基中其他成分的种类和含量不变，改变碳源的种类。培养基配置完成后，加入相同来源和质量的酵母菌后，对其进行培养。酵母菌培养完成后，从培养基中取出2ml培养好的发酵液，放入离心管中离心，测定540nm处的吸光值，得出吸光之后根据之前算出的回归方程可算出发酵液中低聚木糖的含量，也就是酵母菌分解秸秆产生的低聚木糖产量（见图3.1）。
为了进一步对碳源进行优化，在得出最佳碳源为玉米秸秆之后，控制培养基中的其他成分的种类及含量不变，将玉米秸秆的浓度分为10g/L，20g/L，30g/L，40g/L，50g/L。将配置好的培养基放入摇床中培养，3天后取出发酵液，测定吸光度值，根据吸光度值和回归方程算出低聚木糖的产量，最终分析得出最适的玉米秸秆浓度（见图3.2）。
图3.2不同玉米秸秆浓度对低聚木糖产量的影响
图3.1碳源对低聚木糖产量的影响
图3.2碳源浓度对低聚木糖产量的影响
由图3.1可知，当玉米秸秆为碳源时，低聚木糖产量最高，也就是说玉米秸秆是最佳的碳源。由图3.2可知，当玉米秸秆浓度为10g/L时低聚木糖产量过高，无法作为准确的实验结果。所以此处选择低聚木糖产量第二的浓度，即40g/L，作为最适的碳源浓度。
3.1.2氮源及其浓度对低聚木糖产量的影响
本实验选取酵母粉，牛肉膏，蛋白胨，尿素和（NH4）2SO4这5种不同氮源，来进行优化。向培养基中分别加入这五种氮源，控制培养基中其他成分的种类和含量不变。培养基配置完成后，分别加入等量的经过碳源优化的酵母菌，放入摇床中培养。3天后，取出发酵液，测定吸光值，计算出低聚木糖产量（见图3.2）。
根据图3.2可以得出最佳氮源为酵母粉，为了进一步对氮源进行优化，保持培养基中的其他成分不变，将氮源酵母粉的浓度分为1g/L，2g/L，3g/L，4g/L，5g/L五个梯度，培养基配置完成后加入优化过的酵母菌，放到摇床中培养。3天后，取出发酵液测定吸光度值，计算出低聚木糖含量（见图3.4）。
图3.3氮源对于低聚木糖产量的影响
图3.4氮源浓度对低聚木糖产量的影响
由图3.3可知酵母粉作为氮源时，低聚木糖产量最高。其次为蛋白胨，低聚木糖产量最低的是尿素，所以最适氮源是酵母粉。由图3.4可看出当酵母粉的浓度为1g/L时，低聚木糖的产量最高，但是由于该浓度下低聚木糖产量与其他几个浓度的产量差距过大，无法作为最终结果，所以选取3g/L作为最适的氮源浓度。
3.1.3 Mg2 浓度对低聚木糖产量的影响
Mg2 是常见的无机盐，是多种酶的激活剂，可以促进磷酸的形成。为了对Mg2 浓度进行优化，将MgSO4溶液设置成0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L五个浓度梯度，分别放入五个不同的培养基中，在其他条件相同的情况下研究其对于酵母菌产生低聚木糖的影响，从而得出最佳的MgSO4浓度，也就是Mg2 浓度（见图3.5）。
图3.5不同浓度的Mg2 对于低聚木糖产量的影响
由图3.5可知当MgSO4溶液浓度小于0.4g/L时，MgSO4溶液浓度越高，低聚木糖产量越大，当溶液浓度大于0.4g/L时，低聚木糖产量就会呈现下降的趋势，也就是说浓度为0.4g/L的MgSO4溶液就是最佳的Mg2 浓度。
3.1.4不同浓度的Fe2 对低聚木糖产量的影响
Fe2 也是微生物生长所需的一类重要无机盐，为了更好的探究Fe2 浓度对低聚木糖产量的影响，将Fe2 分为0.1g/L，0.2g/L，0.3g/L，0.4g/L，0.5g/L五个不同的浓度梯度，将它们分别放入五个不同的培养基中，在29℃，150r/min的培养箱中培养3天。分别测得五个培养基中溶液的吸光度值，并计算出低聚木糖的含量（见图3.6）。
图3.6不同浓度的Fe2 浓度对低聚木糖产量的影响
由图3.6可知当Fe2 浓度为0.3g/L时，酵母菌产生低聚木糖的量最大，当浓度低于或高于0.3g/L时，酵母菌产生低聚木糖的含量都会有一定的减弱。
3.2正交实验结果分析
通过单因素实验法，已经得出了最佳的碳源，氮源以及其浓度，也分析出了Mg2 和Fe2 两种无机盐的最适浓度，根据这个结果确定四个因素三个水平的正交实验方案，以此来获得生产低聚木糖的最佳的发酵培养基的组合。四个因素分别为玉米秸秆含量，酵母粉含量，Mg2 浓度和Fe2 浓度，各个因素的水平划分，是根据单因素分析法所获得的最适浓度来确定的。具体各因素的实验设计见表1因素水平表。
表3.2正交实验结果
因素 编号 | A（玉米秸秆） | B（酵母粉） | C（Mg2 ） | D（Fe2 ） | 吸光值 | 低聚木糖产量 |
1 | 1 | 1 | 1 | 0.394 | 0.270 | |
1 | 2 | 2 | 2 | 0.498 | 0.361 | |
1 | 3 | 3 | 3 | 0.567 | 0.420 | |
2 | 1 | 2 | 3 | 0.557 | 0.412 | |
2 | 2 | 3 | 1 | 0.423 | 0.295 | |
2 | 3 | 1 | 2 | 0.328 | 0.213 | |
3 | 1 | 3 | 2 | 0.276 | 0.168 | |
3 | 2 | 1 | 3 | 0.386 | 0.263 | |
3 | 3 | 2 | 1 | 0.417 | 0.290 | |
K1 | 1.051 | 0.850 | 0.747 | 0.860 | ||
K2 | 0.920 | 0.919 | 1.062 | 0.741 | ||
K3 | 0.721 | 0.924 | 0.884 | 1.095 | ||
R | 0.330 | 0.074 | 0.316 | 0.354 |
由正交实验表3.2的9组实验结果可以得出3号培养基组合的低聚木糖产量最大，即3号组合是最佳的培养基组合。其次是4号培养基组合。
根据图表3.2的实验结果，可得出最佳的培养基组合为A1B3C2D3，即玉米秸秆浓度为30g/L，酵母粉浓度为4g/L，Mg2 浓度为0.4g/L，Fe2 浓度为0.4g/L。
由极差R可得出对发酵液中低聚木糖产量影响显著性大小依次为D＞A＞C＞B，即Fe2 ＞玉米秸秆＞Mg2 ＞酵母粉。也就是说Fe2 对低聚木糖产量影响最大，其次是玉米秸秆，最后是酵母粉。
结论
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