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摘 要

关键词：零余子 薯蓣皂苷 提取方法优化

Abstract: according to the Dioscin extraction method, the extraction temperature, extraction time, extraction ratio of liquid ratio and extraction medium concentration of several aspects of the gradient optimization experiment, each factors in five different compositional gradient, of the optimal conditions of various factors on the orthogonal experiment. To test the factors and found the extraction efficiency is the highest, again on extraction process and extracting method of dialectical thinking in the literature, found that the experiment can improve the steps in the process of or inadequate. Experimental results for the extraction of ethanol concentration was 85%, the temperature is 80 ℃, extracting time of 6 hours, to extract the material liquid ratio 1.5, extraction yield of 0..556mg/gTheir effect of extraction rate is in the order of extraction temperature gt; ethanol concentratin gt; liquor extraction time

Key word：Dioscorea opposite Dioscin Extraction efficiency optimization

1 前言

1．1 从零余子中提取薯蓣皂苷的动机

薯蓣皂苷是生产甾体激素类药物的主要来源，对其生产起十分关键的作用，其在薯蓣科植物中的含量非常的普遍。甾体激素具有的抗菌消炎治疗过敏和抗病毒以及抗休克的强药理作用，是治疗各种心血管疾病和免疫类疾病的重要用药^【1】。现在发现薯蓣皂苷对抗衰老和去除瘢痕有效，成为了美妆产业的新型热门话题。

零余子为山药（薯蓣科薯蓣）的叶腋间常生有肾形或卵圆形的珠芽，通常被我们称为山药豆或山药蛋，和山药一样有一定的食疗效果。其作用与山药大致相同，具有补肺益气，健脾补虚，固肾益精，等一系列功效，^【2】对三高患者和体质虚弱的病人老人等非常裨益。

零余子更多的是被种植者作为山药种子，而且发芽后含毒不能食用，以致经济价值不高，每年都有大量零余子被掩埋倾倒，造成了大量资源浪费^【3】。从零余子也是薯蓣科植物这一想法出发，准备以零余子为实验对象，寻找从中高效经济提取高附加值产物的方法，可以有效减少对资源的浪费，并可能发现新的资源物质。目前对零余子的主要研究为提取薯蓣皂苷这种化学成分，本文便是对零余子中提取薯蓣皂苷的提取方法优化实验进行报告与总结。

1.2 薯蓣皂苷的提取方法和提取原理

薯蓣皂苷作为药物合成的原料，它主要在植物体内自然合成，我们可以通过调节植物生长和植物内分泌来调整其产量。从植物里分离薯蓣皂苷的方法目前已经实践并使用多种，都是比较成熟的提取方法。最常用的酶解法，还有酸水解法，自然发酵法和溶液萃取法^【4】。

本次实验使用溶液萃取的方法来提取零余子粉末中的薯蓣皂苷。薯蓣科植物体内的薯蓣皂苷大多以薯蓣皂苷元的形态存在，薯蓣皂苷水解可得到薯蓣皂苷元和单糖，利用其易溶于有机溶剂不溶于水的性质，用乙醇连续提取薯蓣皂苷^【5】。

1. 3 测定提取率的方法

目前能够对薯蓣皂苷进行含量测定的方法非常多，比色法，薄层扫描法和液相层析法是主流方法。比色和色谱法都能检测提取皂苷的含量，本次实验中使用比色法，便捷灵敏，不需要昂贵仪器，适用于我们学生实验室。本实验使用甲醇-硫酸法^【6】作为显色方法，比较稳定准确，试剂也容易获取。并且陈战国-等使用显色剂与薯蓣皂苷产生共轭^【7】，最大吸收波长红移动至530nm，其他甾体皂苷元无此类解构，因此能够独特鉴定。

2 实验材料与方法

2.1 材料与仪器

薯蓣皂苷对照品（纯度98％）哈灵生物有限公司；从淮安农贸市场采购的新鲜零余子。其他所用试剂，均为市售分析纯。

北京析普通用仪器有限公司 UV7CR紫外-可见分光光度计；金坛市通亿电子有限公司 HH-S恒温水浴锅；上海荣亚生化仪器厂 RE-5A旋转蒸发器；北京赛多斯利科学仪器系统有限公司 BS24S电子天平 ；上海宏精实验设备有限公司 DHC-940A形电热恒温鼓风干燥箱。

2．2 实验方法

2.2.1标准溶液的配置 精密称取薯蓣皂苷对照品1.2mg于10毫升的容量瓶中，加甲醇溶解并定容，备用。

2.2.2零余子干燥磨粉 把新鲜零余子挑选出没有腐烂和破损以及霉点的，洗净至表面无泥沙，清水漂洗多次后，用不锈钢水果刀一切两半露出内部。

将处理过后的零余子松散地平铺在托盘里，材料之间要有一定间隙，放入鼓风干燥箱里，温度设置在60℃，干燥4小时。干燥过程中注意观察零余子的变化，避免焦化。烘干后将零余子放入高速粉碎机，一次磨10秒，研磨5次，磨成粉末后放入密封药剂罐中备用。

2.2.3 实验思路 用25g干燥零余子粉末精密称定后置于250ml锥形瓶中，加入一定量的一定浓度乙醇，摇匀后在恒温水浴锅中在一定温度下就行回流提取一定时间，冷却后用漏斗过滤并且回收滤渣，再次按照上面操作提取一遍，混合两次滤液，用旋蒸仪进行浓缩至褐色粘稠状，冷却。浓缩液用500ml的纯水溶解，然后使用等体积的石油醚进行脱脂2小时，脱脂两次后取水层，再次用旋蒸仪浓缩至小体积75ml，不再有水分蒸出。用600毫升水饱和正丁醇溶液（分液漏斗里放入1:5的水与正丁醇，摇匀震荡10分钟，放置分层后取上层水饱和正丁醇。）萃取三次（过夜），取正丁醇层并且对其进行旋蒸浓缩，浓缩后减压回收。得到的褐色膏状物用甲醇溶解并定量转移到50ml容量瓶中，作为测定液^【8】。最后进行吸光值测定，对照品溶液位薯蓣皂苷标准品。

表1 对实验的不同因素进行梯度划分

现根据上述因素进行梯度划分，进行实验，温度因素变量实验时其他因素取第一梯度不变，依次进行实验，最后进行正交实验。吸光值测定结果制图。

2.3 薯蓣皂苷提取率的测定

2.3.1 测定吸光值

分别准确吸取零余子样品溶液1 ml置于具塞试管内，挥干溶剂，混匀、密塞，放置在温度设置为60 ℃恒温水浴中显色15分钟, 取出后立即以冰水冷却5分钟,各加入5.0 ml硫酸甲醇溶液，摇匀 静置10 分钟，以标准品溶液为参比,在波长547 nm处测其吸光值平行测定3次，根据标准曲线回归方程计算出提取出药零余子中薯蓣皂苷元的含量。薯蓣皂苷的标准品回归方程为y=0.0554x 0.0776.^【9】

2.3.1.1 乙醇浓度和薯蓣皂苷提取率的关系

图1 乙醇浓度对薯蓣皂苷提取率的影响

根据实验结果，当80％乙醇为提回流提取的乙醇浓度时，提取出的薯蓣皂苷最多，效率最高，因此以80％浓度为定量，再对之后的因素进行梯度变量实验。所有数据均为两次实验平均值。

2.3.1.2 提取时间与薯蓣皂苷提取率的关系

固定料液比为1，乙醇浓度为80％，温度为60℃，进行时间因素的实验，以2小时，4小时，6小时，8小时和12小时的提取时间进行实验，测得吸光值后计算提取率，制成折线图^【8】。

图2 提取时间对提取率的影响

根据实验结果，当乙醇浓度为80％时，提取时间为6h时提取率较高，但是2h向上时间对结果的影响不大。以80％乙醇和6h提取时间为固定因素，进行温度梯度实验。所有实验均为两次实验平均值。

2.3.1.3 提取温度与薯蓣皂苷提取率的关系

固定料液比为1，乙醇浓度为80，提取时间6h，温度以50℃,60℃,70℃,80℃和90℃进行因素实验，在其他条件相同，温度不同的条件下测试温度对提取率的影响。

图3 提取温度对薯蓣皂苷提取率的关影响

实验结果表明，当回流提取的温度设定为80℃时，提取率最高。由于50℃时实验结果无法得到，回流提取的产物无法浓缩，所以50℃时无法进行后续实验。80℃之前提取效率一直呈上升趋势，说明温度越接近80越符合零余子薯蓣皂苷的提取最佳温度，提取率最高的条件。根据实验结果规律，两次实验的平均值显示80℃时效率更优，所以选用80℃作为提取率最高的提取温度。查阅资料得知高温可破坏薯蓣皂苷的结构^【10】，90℃时效率比80℃有所降低，在80℃之前，提取率慢慢增高，90℃时，可能受温度影响，提取率降低。

2.3.1.4 提取料液比对薯蓣皂苷提取率的影响

固定其他因素，液比1,1.2,2.5,3进行单因素变量实验

图4料液比对薯蓣皂苷提取效率的影响

实验结果表明当料液比1.5时，提取效率最高。

在1.5时实验提取薯蓣皂效率最高，料液比大于1.5后开始降低。可能在大于1.5的料液比中薯蓣皂苷的提取率不高。尤其是过了2的料液比后，提取率降低很多。较高的料液比提取率反而会降低。

总结得出，使用乙醇对零余子中的薯蓣皂苷的回流提取，提取效率最高因素：温度为80℃，提取时间为6h，乙醇浓度为80百分之，液料比为1.5。进行正交实验来确认实验结果的代表性。

2.3.1.5 正交实验

以提取率最高的单因素为基础，设计9组正交实验探究各个因素对薯蓣皂苷的提取得率的影响，筛选出最优的单因素组合成为最优提取方案。

表2 正交实验因素水平表

表3正交实验极差分析结果

由单因素实验的结果选取因素，进行L9正交实验，实验结果如表2.可以观测出，对零余子薯蓣皂苷的回流提取影响一直较大的为乙醇浓度和液料比，影响最大的为提取温度，提取时间对提取效率的影响最小。根据实验结果极差分析，选出的最优的提取效率组合为A2B3C2D2。进行三次实验测定平均值，得到的提取率为0.556mg/g，普遍比之前的实验高。

结论

对于薯蓣皂苷的溶液萃取工艺进行优化实验后，得出结论为对薯蓣皂苷的提取效率影响最大的因素是温度，其次是乙醇浓度和液料比，最后是提取时间。为了对提取方法进行优化，最佳的条件选择为80℃提取温度，85％乙醇浓度，1.5液料比和6小时提取时间，所得到的提取率为0.556mg/g。

通过实验可知，在其他条件一定的情况下，温度和液料比以及提取液浓度是薯蓣皂苷的回流提取中比较关键的因素，分析认为可能因为选用的是乙醇作为提取物质，乙醇萃取其他有机物的效率大多跟浓度成正比^【11】，所以酒精浓度和提取效率呈正相关，而温度的受限因素可能和乙醇的物理性质有关。可能因为连续回流提取时，超过80℃的温度会使乙醇沸腾，导致萃取相产生变化^【12】，而且高温的确会对乙醇对薯蓣皂苷的提取产生不利影响^【13】。但是在乙醇沸点之前，提取率也会随温度的升高而增加，可能是乙醇局限了温度对提取率的影响力。

展望：工业生产中可能使用其他物质回流提取薯蓣皂苷^【14】温度对其影响可能会变小。但温度控制在一定幅度内，提取率可以保持较高，降幅很少，可以根据实际生产的节能以及成本考虑，选择温度。乙醇浓度和料液比对薯蓣皂苷的提取效率影响比较大，而且与提取率的变化关系密切，略微的改动就能很大地影响到提取率。本次实验证明零余子是可以被简单易行的方法提取出薯蓣皂苷的，能掌握好提取温度和提取物液料比就能以较高的效率提取薯蓣皂苷，应用于实际生产。

本次实验提取率比以往文献的提取率低了一点，经过仔细对比，发现了本次实验不足之处：1、在原料处理过程中，由于原料量大而实验室人力少，不能把所有零余子去皮，只能切块。在后续实验的浓缩过程中发现了很多褐色絮状物，后来发现和没有去皮有关^【15】，而且含量测定较少。在淮山药的薯蓣皂苷含量测定中，使用了护色液来防止淮山药氧化^【16】。我们实验中没有此步骤，在干燥后零余子全部变黑氧化，可能也对后续的实验结果产生了影响。去皮和防止氧化是否能够提高提取率还不得而知，需要进一步进行实验验证。

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致 谢

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