论文总字数：6045字

摘 要

近年来，环境污染已成为全球性的问题，随着工业的不断发展，水体的富营养化已然打破了原有的生态平衡。而浮萍是一群快速增长的小型水生植物，能分解部分化合物、吸收氮、磷和有机物等营养物质，因此利用浮萍可以对污水进行氮磷的处理与转化，这已成为环境领域研究热点之一。本研究是对编码核糖体5S rDNA的浮萍基因进行克隆和比对分析，希望从供试材料中找出不同种间的差异，为实际应用提供理论指导。

关键词：浮萍，核糖体DNA，基因克隆，序列比对

Abstract: In recent years, environmental pollution has become a global problem. With the development of industry, the eutrophication of water has already broken the original ecological balance. Duckweed is a fast-growing group of small aquatic plants that can decompose, absorb nitrogen, phosphorus and organics and other nutrients. It has become one of hotspot in research environment. In this study, we cloned and compared the duckweed genes encoding ribosomal DNA, hoping to find out the differences among the different species and provide theoretical guidance for the practical application.

Key words: duckweed, ribosomal DNA, gene cloning, sequence alignment

目录

1 前言 5

2 材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 材料 5

2.1.2试剂 5

2.1.3 仪器与设备 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 目的基因扩增 6

2.2.2 目的基因克隆 6

3 结果与分析 7

3.1 5S rDNA间隔区基因克隆 7

3.1.1间隔区扩增分析 7

3.1.2 间隔区基因克隆 8

3.1.3 阳性克隆检测 8

3.1.4 不同物种间隔区序列比对 9

结 论 10

参 考 文 献 11

致 谢： 12

1 前言

浮萍植物是对浮萍科植物的总称，它是世界上最小，生长速度最快，形态最简单的开花植物^[1-2]。浮萍科分5个属约40个物种，按照植株大小依次为紫萍属(Spirodela)，斑萍属(Landoltia)，青萍属(Lemna)，扁无根萍属(Wolffiella)，无根萍属(Wolffia)^[3-4]。

由于浮萍的基因组相对简单，且对环境的抗逆性较强，多年来被广泛应用于植物生理学、生态学等相关领域研究^[5]，并广泛应用于由工业发展导致的富营养化水体修复^[6]。同时，在富营养化水体中生长的浮萍也可作为一种新型的生物能源，用于提供优质廉价的蛋白质或用于生物酒精等增值产品的生产^[7-9]。

研究浮萍生长速度的分子机制有助于我们理解浮萍物种的系统特征并拓宽其实际应用价值^[10]。本研究采用分子生物学技术，通过对浮萍核糖体亚基5S rDNA的重复间隔序列区基因扩增、克隆和序列比对，研究生长于德国的不同浮萍品种之间的序列差异，以期从分子生物学角度了解核糖体亚基间隔区与浮萍生长速度的关系，为浮萍的进一步加工生产提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 材料

本研究所用的2个供试材料Lemna yungensis浮萍基因组DNA由实验室团队领导人Nikolai从德国收集获得，实验室编号为9207和9209。

2.1.2试剂

PCR引物由赛百盛基因技术有限公司合成；Solution I、pMD19-T Vector (50ng/μL)及各种限制性内切酶均购于宝生物工程有限公司(TaKaRa)；dNTPs(2.5mM)、Taq DNA Polymerase(5U/μL)、DL5000 DNA Marker、10×Taq酶反应缓冲溶液购于北京佳兰生物科技有限公司；大肠杆菌感受态细胞(Escherichia coli DH5a)由实验室冷冻保存；exDNA凝胶回收试剂盒由淮安百慧公司生产；DNA测序由上海生工测序部完成。

2.1.3 仪器与设备

普通PCR扩增仪、无菌操作台、离心机、电热恒温振荡水槽、全温振荡培养箱、纯水系统、移液器、电子天平、电泳槽、电泳仪、凝胶成像系统等。

2.2 实验方法

2.2.1 目的基因扩增

1、引物设计

根据5S rDNA的保守基因序列，利用引物设计软件primer 5分别在5S rDNA上设计引物5S-F1和5S-R1，引物序列如下：

5S-F1：CTT GGG CGA GAG TAG TAC TAG G；

5S-R1：CAC GCT TAA CTT CGG AGT TCT G。

2、目标基因扩增

以从浮萍中提取的总DNA作为模板，5S-F1、5S-R1作为引物进行扩增（表1），PCR反应程序为94℃预变性2分钟，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环后继续在72℃延伸5分钟，最后4℃保存。

3、电泳分析

PCR反应结束后，对PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，分析使用的为1%的琼脂糖胶。在100V电压下恒压电泳25分钟左右，电泳结束后将琼脂糖胶取出并置于凝胶成像系统观察结果。

2.2.2 目的基因克隆

由于浮萍5SrDNA的非转录间隔区域有多个，各间隔区的碱基序列不尽相同。因此很难直接通过PCR产物直接进行测序，本研究通过将PCR产物克隆到pMD19表达载体，进而对单一序列进行测序分析。

1、TA连接

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