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摘 要

通过PCR技术在实验室合成目标的腈水解酶，在通过基因修饰等基因工程步骤，讲目标基因插入PET-22B的Nde I和Sal I之间，来源于Arabidopsis thaliana nitrilase 1腈水解酶原核生物表达载体PET Nit1。通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定出重组克隆 ,在大肠杆菌BL 21 (D E3)中表达出了一种特异蛋白，并测定酶活性。

关键字：腈水解酶，PET-22B，基因工程，SDS-PAGE，酶活性

From the construction and expression of the prokaryotic expression system of Arabidopsis thaliana nitrilase 1 nitrile hydrolase

Abstract

through the PCR technology in the laboratory synthesis of target nitrilase, then through genetic modification of genetic engineering steps, between the target gene was inserted into PET-22B Nde I and Sal I, building Arabidopsis thaliana nitrilase 1 nitrilase prokaryotic expression vector PET Nit1. The recombinant clone by SDS-PAGE gel electrophoresis, in Escherichia coli BL 21 (D E3) expressed in a specific protein, and enzyme activity determination.

Keywords: nitrilase,PET-22B, genetic engineering, SDS-PAGE,enzyme activity

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 睛水解酶 1

1.2 本论文的研究内容与意义 2

第二章 重组质粒的构建 3

2.1 实验材料 3

2.2 基因的来源 6

2.3 感受态大肠杆菌的制备 6

2.4 构建的T载体的蓝白班筛选 6

2.5 T载体和载体质粒DNA提取 7

2.6 质粒的构建 7

2.7 连接产物转化大肠杆菌 9

2.8 质粒DNA提取与酶切鉴定 10

2.9 PET-22B Nit1诱导表达，提取及鉴定 10

第三章 结果与讨论 12

3.1 基因的扩增与鉴定 12

3.2 载体的获得 12

3.3 载体的酶切反应 13

3.4 目标基因的胶回收 13

3.5 基因重组表达载体的酶切鉴定 14

3.6 诱导表达蛋白质、SDS-PAGE电泳 14

3.7 酶活测定 15

第四章 结论与展望 16

4.1 结论 16

4.2 展望 16

致谢 17

参考文献： 18

第一章 文献综述

1.1 睛水解酶

腈化合物(R-CN)是一类非常重要的化合物，它的种类非常的繁多，现在自然中和人工合成的各类腈类化合物总数超过了 20000多种，然而在所有的腈类化合物中，大部分来自于人工合成^[1]。腈类化合物也可以通过植物自身的合成产生，往往可以作为激素的前体物质(苯苯甘氨腈)，或者植物体内的存储化合物(腈脂)等等^[2]。我们都知道，腈类化合物在工业上的重要应用是其往往能够作为底物，然后通过化学方法合成一些所需的医药中间体或者其他有用的物质。然而，目前工业上的腈类水解所采用的化学方法受到很大局限，因为其需要非常苛刻的条件，比如强酸、强碱或者高压等^[3]，而且产生的不期望的副产物具有一定的毒性，容易对环境造成危害。截然不同的是，腈类物质通过生物催化来产生对应的羧酸和酷胺类物质，此过程能够在很温和的条件下发生，而且产物具有较高的立体选择性^[4]。通过大家都广泛熟悉的例子，比如丙烯酰胺的生产，生物法转化腈类化合物的潜力已经得到了证明^{[5, 6]}。

腈类化合物的生物催化目前来说，主要是通过两种途径。一种是腈类化合物在腈水解酵的作用下通过一个直接的生物转化，释放氨从而形成对应的羧酸^[7]。在80年代初，另外一种生物催化腈类化合物的方式也被发现，首先腈类化合物被水解成为酰胺类物质，随后再在酰胺酶的作用下生成对应的羧酸^{[8, 9]}。

腈水解醇，作为第一个腈类转化醇，大概最早是在40年前发现，能够水解有机腈产生羧酸和氨。其因为能够转化3-吲哚苯甘氨腈生成3-n引哚乙酸而闻名^[10]。不像腈水合酶，腈水解酶在自然界各种存在的生物中发现，包括细菌、真菌、古细菌、植物和哺乳动物，其中细菌是腈水解酶的主要来源^[8]。

根据底物的特异性，腈水解酶普遍被分为三类:(1)芳香类腈水解酶，比如Rhodococcus rhodochrousn和一些真菌酶，它们主要是水解芳香腈^{[11, 12]}。(2)脂肪类腈水解酶，tt如Krhodohmus K22和Acidovorax faeccilis 72W菌株产生的腈水解酶，它们主要是水解脂肪族的氰基。(3)芳基苯甘氨腈水解酶，主要能够水解芳基苯甘氨腈类物质。这个分类一直沿用到现在，即使一些腈水解酶表现出了更宽的底物专一性，能够被同时的划分到不同类^{[13, 14]}。

1.2 本论文的研究内容与意义

(1) 腈水解酶基因的获取及质粒的构建

(2) 腈水解酶在原核生物体内的表达

(3) 蛋白质的测定及酶活的测定

第二章 重组质粒的构建

2.1 实验材料

2.2.1 主要仪器

本论文中所用的实验设备及仪器如表 2-1 所示。

表2-1实验仪器

2.1.2 实验试剂

本论文中所用的实验试剂如表 2-2所示。

表2-2实验试剂

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