展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面的L-阿拉伯糖异构酶的酶催化体系优化毕业论文
2022-06-23 08:06
论文总字数：18496字
摘 要
D-塔格糖是近年来被发现的一种具有特殊的生理特性与功能的甜味剂，它的甜度与蔗糖相似，但人体小肠对其的吸收率却只有20%左右，不仅如此，它还具有降低血糖、防治龋齿、促进肠道菌群生长的功效。
D-塔格糖极少存在于自然界中，但是通过生物转化或者化学转化方法可以大量获得D-塔格糖。目前 L-阿拉伯糖异构酶是生物法工业化生产D-塔格糖的最有效的酶。
本研究致力于研究展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面的L-阿拉伯糖异构酶的转化过程中的最适温度、最适pH、以及温度的稳定性和该酶批次转化底物的效率。本文取得主要研究成果如下：
1.将成功展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面的L-阿拉伯糖异构酶进行了酶催化体系的优化，酶催化的最适条件为70 ℃，pH6.5。在热稳定性实验中，展示在芽孢表面的L-阿拉伯糖异构酶在80 ℃下处理30 min，酶的活力仍然能保持在85%以上。
2.利用展示在枯草芽孢杆菌芽孢表面的L-阿拉伯糖异构酶进行酶催化批次实验时，利用底物浓度为100 g/L的D-半乳糖，转化24 h后转化率达到75%，在第三个批次转化率仍然能达到56%。
关键词： D-塔格糖 L-阿拉伯糖异构酶 表面展示 枯草芽孢杆菌
Optimization of Enzyme Catalysis System for
L-Arabinose isomerase which Display on the Surface of
Bacillus Subtilis
Abstract
D-tagatose, a sweetener, with a special physiological features and functionality, was to be found in recent years. D-tagatose is similar to the sweetness of sucrose, but human intestinal absorption rate is only about 20%, not only that, it also have the effect of lower blood sugar, prevent tooth decay, and promote the growth of intestinal bacteria.
D-tagatose is rarely found in nature, but we can obtain large quantities of D-tagatose by biological or chemical transformation method. Currently Arabia L-Arabinose isomerase is one of the most effective enzyme production of D- tagatose biological industrialization.
This study focuses on the optimum temperature, optimum pH and temperature stability which on transformation process of the enzyme catalysis system for L-arabinose isomerase which display on the surface of Bacillus subtilis.
In this paper, the main research results are as follows:
1. The enzyme catalysis system for L-Arabinose isomerase which successful display on the spore surface of Bacillus subtilis were optimized, optimal condition of enzyme catalysis was 70 ℃, pH6.5. L-Arabinose isomerase which displayed on the surface of Bacillus subtilis treatment for 30 min at 80 ℃, enzyme activity remained at more than 85%.
2. The L-Arabinose isomerase which displayed on the spore surface of Bacillus Subtilis, was used in enzymatic batch experiments，the optimal substrate concentration was 100 g/L D-galactose, the conversion rate reached 75% after 24 h conversion, and the conversion rate can still reach 56% in third batch.
Key words: D- tagatose L-Arabinose isomerase surface display
Bacillus Subtilis
目 录
摘 要 I
Abstract II
第一章 文献综述 1
1.1 研究背景及现状 1
1.1.1 D-塔格糖 1
1.1.2. L-阿拉伯糖异构酶 1
1.1.3 L-阿拉伯糖异构酶 的催化体系优化 2
1.1.3.1 L-阿拉伯糖异构酶催化体系的最适反应温度 2
1.1.3.2 L-阿拉伯糖异构酶催化体系的最适催化pH 2
1.1.3.3 L-阿拉伯糖异构酶催化体系的催化效率 2
1.1.3.4 影响L-阿拉伯糖异构酶催化体系的其他要素 3
1.1.4 表面展示技术 3
1.2 研究目的及意义 3
1.2.1 D-塔格糖的应用前景 3
1.2.2 工业化生产D-塔格糖 3
1.2.3 L-阿拉伯糖异构酶表达的关键问题 4
1.2.4 本研究的方法、目的和意义 4
第二章 实验材料与方法 5
2.1 实验仪器 5
2.2 实验材料 5
2.2.1 主要实验试剂： 5
2.2.2 培养基 6
2.3 芽孢的离心纯化 6
2.4 L-阿拉伯糖异构酶的酶活最适最适温度 6
2.5 半胱氨酸咔唑法测定L-阿拉伯糖异构酶的酶活 7
2.6 L-阿拉伯糖异构酶的酶活最适最适pH 7
2.7 酶的热稳定性实验 7
2.8 血球板计数法测定芽孢数量 7
2.9 酶活力验证和酶降解实验 8
2.10 确定底物浓度 8
2.11 HPLC测定D-塔格糖含量 9
2.12 标准曲线的制作 9
2.13 最适芽孢用量（浓度）的确定 9
2.14 批次转化 9
第三章 实验结果与讨论 11
3.1 L-阿拉伯糖异构酶的酶活最适最适温度 11
3.2 L-阿拉伯糖异构酶的酶活最适最适pH 11
3.3 酶的热稳定性实验 12
3.4 芽孢计数实验 13
3.5 酶活力验证和酶降解实验 14
3.6 HPLC测定D-塔格糖含量 15
3.6.1 标准曲线的制作 16
3.6.2 转化率与得率的计算 16
3.7 最适芽孢用量（浓度）的确定 17
3.8 批次转化 17
第三章 结论与展望 19
4.1 结论 19
4.2 展望 19
参考文献 20
致 谢 22
文献综述
1.1 研究背景及现状
1.1.1 D-塔格糖
D-塔格糖是一种六碳酮糖，是D-半乳糖的异构物。分子式 C6H12O6 ，相对分子质量180.16。D-塔格糖是白色无臭结晶性粉末，味甜，甜度接近于蔗糖，但其产生的热量仅为蔗糖的1∕3（1.5 kca ∕g) [10]。D-塔格糖的熔为132~135 °C，其溶于水，水中溶解度为62%（30 °C）。D-塔格糖对热稳定，玻璃化温度15 °C，易结晶，吸湿性低。D-塔格糖耐酸性强，在pH 2~7范围内稳定。D-塔格糖易发生焦糖化反应和美拉德褐变反应。天然的塔格糖主要存在于酸乳、奶粉等乳制品中。D-塔格糖被用作低热量甜味剂、阻湿剂、组织改进剂、稳定剂等等[1]。图1.1 为D-半乳糖D-塔格糖的化学结构式。
图1.1 D-半乳糖D-塔格糖的化学结构式
1.1.2. L-阿拉伯糖异构酶
L-阿拉伯糖异构酶是一种催化D-半乳糖转化为D-塔格糖的异构化酶，由于它在C3、C4位置上有L-型顺式羟基结构，所以L-阿拉伯糖异构酶能在体外将D-半乳糖变为D-塔格糖。因此L-阿拉伯糖异构酶是工业化生物法生产D-塔格糖最有效的一种酶[2]。L-阿拉伯糖异构酶催化的异构化反应如图1.2所示。L-阿拉伯糖异构酶 存在于多种微生物中，如E．coil，Lactobacillus plantarum、Thermotoga maritima、Thermotoga neapolitana，等。运用基因工程手段使L-阿拉伯糖异构酶在枯草芽孢杆菌中大量表达，能够利用它规模生产D-塔格糖[18]。由于现今人们对D-塔格糖的广泛关注, L-阿拉伯糖异构酶也因此成为人们研究的对象。
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