论文总字数：15303字

摘 要

随着全世界范围重金属污染问题的加剧，研发新的环境友好处理工艺从土壤中去除重金属已经成为环境工程领域一个重要的方向。成团泛菌在对Cu² 去除作用中表现优越，具有广阔的应用前景。

本文利用成团泛菌作为菌样，针对Cu² 浓度、接种量、pH三种变量进行优化研究。首先在Cu² 浓度变量实验中设置了10-400mg/L的多组梯度浓度实验。试验结果表明在300mg/L以下的浓度环境中，成团泛菌对Cu² 的去除率都超过30%。而接种量对其去除率提升无明显影响，但在有限的营养环境中接种量提升反对其去除作用起抑制作用。在酸性pH环境下成团泛菌的生长明显受到抑制，而在弱碱性环境中，成团泛菌生长良好且去除作用明显。

关键词:成团泛菌，Cu² ，微生物修复，pH，去除率。

Soil Copper Contaminated Microbial Remediation

Abstract

With the increasing worldwide problem of heavy metal pollution, develop new environment-friendly treatment process to remove heavy metals from the soil in the field of environmental engineering has become an important direction.Pantoea performed well in Cu² removal action , has broad application prospects.

In this paper,Pantoea was used as bacteria-like.We studied with three variables,Cu² concentration, inoculum and pH.First set up multiple sets of concentration gradient experiments varied from 10mg/L to 400mg / L .The results showed that the Cu² removal rate is more than 30% when the concentration of Cu² is less than 300mg/L.Increasing the inoculum of Pantoea makes no effect of Cu² removal rate,but in a nutrition-limited environment,it would against its removal effect. Under acidic pH environment, the growth of Pantoea was significantly inhibited, and in a weak alkaline environment, Pantoea growing well and the removal effect is obvious.

Key words:Pantoea,Copper contaminated,Microbial remediation,pH, Inoculum,removal rate, Cu² concentration.

摘要 I

Abstract II

第一章 文 献 综 述 1

1.1重金属污染 1

1.1.1重金属Cu作用及其毒性 1

1.2土壤重金属污染修复办法 1

1.2.1 物理修复 1

1.2.1.1 物理工程措施 1

1.2.2 化学修复 2

1.2.2.1 固化技术 2

1.2.2.2 电化学法 2

1.2.2.3 淋洗法 2

1.2.2.4 改良剂法 2

1.2.3 土壤重金属污染的生物修复 2

1.2.3.1 植物修复 3

1.2.3.2 动物修复 3

1.2.3.3 微生物修复 3

1.3 微生物修复的发展前景 3

1.4 本课题研究内容、目的及意义 4

1.4.1 本课题研究目的及意义 4

1.4.2 本课题的主要研究内容 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1实验材料 5

2.1.1主要试剂及仪器 5

2.1.1.1主要试剂 5

2.2实验方法 6

2.2.1 培养基的配置 6

2.2.2菌株的筛选 6

2.2.3 菌种活化 7

2.2.4 培养基接种培养 7

2.2.5 菌种培养、取样及样品处理 8

2.2.6 OD₆₀₀测定 8

2.2.7 二乙氨基二硫代甲酸钠萃取光度法测定铜离子浓度 8

2.2.7.1 所需试剂 8

2.2.7.2 显色萃取 8

2.2.7.3 校准曲线 9

2.2.7.4 计算 9

2.2.7.5 标准曲线测定 9

第三章 结果与讨论 10

3.2 Cu² 浓度的影响 10

3.3 接种量的影响 11

3.4 培养基pH对成团泛菌去除率的影响 13

第四章 结论与展望 14

4.1结论 14

4.2 展望 14

第一章 文 献 综 述

1.1重金属污染

随着近几十年来现代工业飞速发展、城市生活垃圾的剧增和农业生产行为中农以及化肥的大批量使用，人们的生活环境受到了严重的重金属污染。污染对土壤、水体和空气都造成严重的影响。部分重金属具有很强的生物毒性，即使在低浓度下也可以对生物造成严重的危害，如、砷、铅、汞、镍、镉等。因为人们的生产活动和日常生活所产生的具有毒性的重金属元素铜、钴、镍、锡、钒等污染物，这些污染物会对大气、水体、土壤和生物圈等的环境污染就是重金属污染^[1]。重金属污染可分为大气中的重金属污染、水体中的重金属污染和土壤中的重金属污染^[2,3]。工业和矿业污水和日常生活产生的污水等没有经过合适的处理就向环境中排放，使土壤和水体受到污染，垃圾弃置的场地受水流冲洗，外加大气中也有重金属含量很高的沉降物进入水体中，使水体重金属浓度快速飙高，导致水体受到重金属污染^[4-8]。金属矿产的开采、居住环境城市化建设、含有重金属的各种垃圾积累和在农业中为提高生产而使用化肥和农药，浇灌用水受污染等，都可能使土壤中的重金属浓度大幅度提升^[9-18]。富集在土壤内的重金属能够经过淋溶作用污染水体，也能够通过植物的吸收作用进入农作物中危害人体健康^[18,19]。。

生物无法降解进入到环境之中的重金属元素，并且重金属容易进入到食物链并在生物体内富集从而威胁生物健康，影响生物多样性的同时也危害着人类的健康。如何修复重金属污染是目前所需要解决的重要问题^[20]。

1.1.1重金属Cu作用及其毒性

在多酚氧化酶中，Cu是其组成部分，Cu也能够撑持梭化酶的效力，呼吸作用也有Cu介入，细胞内的自由基也能被Cu清除。铜可以在多种生物活动起着关键的作用，但过多的铜会引起有害轻基的形成，引起脂质过氧化和核酸断裂^[21]。

1.2土壤重金属污染修复办法

1.2.1 物理修复

1.2.1.1 物理工程措施

物理工程修复的方法有排土、换土、表土去除、客土和深耕翻土等。用干净的土与受到污染的土进行混合是一种相对使用较多的方法，使用固定比例的干净的土和受污染的土混合，获取的混合图样中重金属的浓度就较之前低。深耕翻土是使用深层耕土，将上下层土壤充分混合，从而减少表层土壤里的重金属浓度。

1.2.2 化学修复

1.2.2.1 固化技术

固化技术是使用一定比例化学固化剂加入到污染土壤中，固化剂和土壤中的重金属形成稳定强且渗透性很差的化合物，这样的化合物不易被动植物摄取也不易被水体溶解带走，从而降低这些污染物对环境的危害。受到重金属或辐射性物质污染土壤的去污染化较多采用该种方法。

1.2.2.2 电化学法

电化学法修复是通过电场引导作用让土壤中的重金属离子定向富集在电极附近，然后使用特定的方法收集这些重金属离子加以处理回收。这种方法适用于金属离子流动性较强的土壤环境中，可以控制金属离子的流向。

1.2.2.3 淋洗法

淋洗法是一种将土壤用大量淋洗液反复淋洗来洗去土壤中的重金属离子，主要适用于有较多空隙的污染土样。在浸出过程中，土壤污染物的充分浸出液，通过化学和物理溶解的影响，通过泵抽液将污染物从土壤中分离，通常需要多次反复淋洗才能够将土壤污染物浓度降低到安全水品。淋洗液可以通过处理来回收重金属，淋洗液也可以反复使用。

1.2.2.4 改良剂法

改良剂法是通过使用化学改良剂钝化土壤中的重金属元素，抑制其生物危害性。这个过程需要向土壤中加入改良剂。

1.2.3 土壤重金属污染的生物修复

在微生物研究领域中，研究人员发现自然界中部分微生物能通过吸附作用或者自身的代谢作用弱化或消除重金属的毒害作用。利用这些微生物可以实现自然净化的目的，这项技术也有很大的发展潜力^[22]。

生物修复是使用人为培育的或自然的生物来净化环境污染的环境修复方法。因为环境问题日益严重，社会对环境修复技术的需求增大，各种生物形态对环境的修复可能都受到广泛关注，研究主要集中在动植微生物和藻类^[23-30]。生物治理法在各种污染的修复领域中有着不可替代的优势，运用最贴近自然的方法对污染物进行生物降解或生物回收。其中部分微生物以其特有的极端环境适应性，在一些特殊污染环境治理中具有其独特的作用[30]。物理化学修复方法中存在的劳力需求大或耗能高甚至二次污染的弊端，生物修复有着相当巨大的发展潜力和优势。

1.2.3.1 植物修复

植物修复是指使用自然环境中的植物或者使用基因工程技术人工培育的植物对重金属污染环境进行修复的技术^[30]。部分植被的根部能够吸取土壤中藏有的重金属元素，并将其转变为气体形态物质蒸发，降低土壤的重金属污染程度。还有些植物能够吸收土壤中的重金属元素并在植株内积累，通过处理这些植株可以达到处理重金属的目的。

1.2.3.2 动物修复

将重金属元素在水中通过食物链，通过藻类-草食鱼-肉食鱼的传递方式富集，使用特定选育的鱼类和其余的水生植物或水藻在水体中摄取并收集重金属毒性物质，然后通过捕捞这些动物将其分离出去处理，从而净化水体。还有部分虫类如蚯蚓，能共吸收土壤中的有毒重金属并进行富集，且蚯蚓能提高土壤本身肥力，是一种优良的土壤修复方式。

1.2.3.3 微生物修复

对于水体污染，可利用水体中的微生物和藻类。向污染水体中补充经驯化的高效微生物或藻类。在特定的环境中通过生物还原反应把有害重金属离子还原。或者可以对重金属进行吸附，然后抱团沉降。通过这种手段实现对受到重金属污染的水体的修复工作。某些土壤微生物对重金属有特殊的降解能力，一般可以通过吸收、沉淀、氧化或还原等方法，一直土壤中有害重金属的危害性。微生物还可通过富集、转变、絮凝沉降、吸附等作用去除或削弱有害重金属的危害。

1.3 微生物修复的发展前景

微生物以其独特的吸附性和极端环境适应性，在污染修复领域有着独特的有事，有着不可替代的地位。微生物种类繁多，生长周期短，利于选育驯化，且能够适应绝大多数污染环境。另一方面微生物的生长几乎不需要人为刻意维持特定环境，且净化效率高。还刻意回收一些贵重重金属，通过对微生物的集中回收，重新提炼其中的贵重金属，能够创造二次价值。在微生物育种技术日益发展的今天，微生物几乎刻意承担起任何恶劣环境的修复工作，人为编码和定向筛选育种技术给微生物修复技术提供了极大的发展前景。该项技术也日益趋于成熟。

1.4 本课题研究内容、目的及意义

1.4.1 本课题研究目的及意义

研究表明，重金属土壤污染已经相当普遍，极大程度的威胁到了农业发展和人类的生命健康。利用微生物进行土壤修复去除土壤内的重金属以提高土壤活力，降低对人类的危害性，并且有可能利用微生物回收土壤内的重金属，达到一举多得的效果。

1.4.2 本课题的主要研究内容

本课题针对成团泛菌吸附铜离子的性能进行优化研究，针对pH、接种量、铜离子浓度三种条件进行优化研究，以提高成团泛菌去除铜离子的效率。

第二章 实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要试剂及仪器

2.1.1.1主要试剂

表2-1实验主要试剂列表

2.1.1.2主要仪器

表2-2实验主要仪器列表

2.2实验方法

2.2.1 培养基的配置

LB（100ml体系）: 0.5g酵母膏

1.0g蛋白胨

1.0g氯化钠

蒸馏水定容至100ml

调节pH至7.0

实验选用LB液体培养基来进行实验。具体配置步骤为，取2.5g酵母膏，5.0g蛋白胨及5.0g氯化钠加入1000ml锥形瓶内，加入500ml蒸馏水。待完全溶解后，平均分装到5个250ml锥形瓶内，每个锥形瓶内为100ml培养基。根据实验批次需要选择是否用pH计调节培养基pH值（若有pH变量则在调节后对锥形瓶分别进行标记）。用胶塞塞紧瓶口，再用双层牛皮纸覆盖并包住瓶口，然后用橡皮经包扎。接着纳入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌处理，灭菌条件为121摄氏度，灭菌时长30min。

2.2.2菌株的筛选

通过对抗重金属铜菌株的富集及筛选，从活性污泥中筛选能够去除重金属铜的菌株，并进行纯化，保菌。并且经过鉴定，结果显示为一种成团泛菌。其菌落形态如下图所示：

图2-1 成团泛菌菌落形态

2.2.3 菌种活化

从冰箱内取出冷冻的成团泛菌菌样（30%甘油管保存），在室温下等待融化。打开超净台紫外灯，灭菌10-15分钟后，关闭紫外灯打开照明灯和风机。在酒精灯火焰环境下打开灭过菌的装有LB液体培养基的锥形瓶，用移液枪吸取10mlLB液体培养基加入到50ml离心管内。再从已经融化的成团泛菌菌样中用移液枪按1%接种量吸取菌液加入到离心管内。盖好用到的所有容器之后，灭掉酒精灯，关闭超净台。将50ml离心管放入37℃摇床内，180rpm转速下摇晃培养12小时。取出离心管重复以上操作二次活化。

2.2.4 培养基接种培养

打开超净台紫外灯，灭菌10-15分钟后，关闭紫外灯打开照明灯和风机。将摇床内二次活化12小时后的50ml离心管取出放入超净台，点燃酒精灯，用酒精棉擦拭双手和台面。将经过高压蒸汽灭菌的装有LB液体培养基的锥形瓶放入超净台内，并根据该锥形瓶内所要加入的CuSO4和菌液的量在锥形瓶上用记号笔做好标记。在酒精灯火焰环境下打开装有LB液体培养基的锥形瓶，用移液枪加入CuSO₄溶液（根据当前实验批次所选取的实验变量加入定量的CuSO₄溶液），混匀后从每只锥形瓶中各取2ml样液，用2ml离心管分装并标记（用于测定初始Cu² 浓度）。再用移液枪从二次活化12小时后的50ml离心管内取菌液加入到锥形瓶内（根据当前实验批次所选取的实验变量加入定量的菌液），摇匀后再各取2支2ml样液于2ml离心管内，并进行标记（标记取样时间和Cu² 浓度或接种量或培养基pH值以及是否经过离心，下文中标记同理）。

2.2.5 菌种培养、取样及样品处理

把经过上述步骤处理的锥形瓶放入摇床内，设定37℃（非温度变量实验，若为温度变量实验则改变其设定温度）、180rpm转速，进行培养。在2h、4h、6h、8h、10h、24h时，从各锥形瓶内各取1组，即2支2ml样液于2ml离心管内并进行标记。从每组中各取一支样品放入高速离心机中离心处理。设定转速12000rpm，时间2min。取出离心后的离心管，将其装有的样液分别倒入准备好的离心管内，并分别进行标记。

2.2.6 OD₆₀₀测定

将上述步骤中所取的所有未经离心且含有菌样的样品以1样品:3蒸馏水的比例混合，使用分光光度计在λ=600进行测量，并作下记录。

2.2.7 二乙氨基二硫代甲酸钠萃取光度法测定铜离子浓度

2.2.7.1 所需试剂

① 四氯化碳。

②（1 1）氨水。

③ 0.2%二乙氨基二硫代甲酸钠溶液：准确称量0.2g试剂，用水稀释至100ml，保存 于棕色玻璃瓶内，置于在暗处贮藏，保存期限两周。

④ 0.4g/L甲酚红指示液：准确称量0.02g试剂，用50ml的95%乙醇将其溶解。

⑤ EDTA-柠檬酸铵溶液：准确称量5g EDTA及20g柠檬酸铵，用水溶解并稀释至 100ml，待完全溶解后，加入4滴甲酚红指示液，在精密pH计辅助下，用（1＋1）氨 水调节PH至8－8.5（由红色变为浅紫色）。

⑥ 氯化铵-氢氧化铵缓冲溶液：准确称量70g氯化铵溶于适量水中，两驱570ml氨水 加入体系中，再用水稀释至1000ml。

⑦ 铜标准贮备溶液：以1g/L Cu为标准准确称量0.39gCuSO₄·H₂O溶于100ml水中。

⑧ 铜标准溶液：用移液枪取500μl铜标准贮备溶液于100ml容量瓶中，用水稀释并定 容，该溶液Cu浓度为5.00μg/ml。

2.2.7.2 显色萃取

①吸取适量的试样（含铜量少于30μg，体积不多于50ml）加入到125ml分液漏斗中， 加水稀释到50ml。

②加入10ml EDTA-柠檬酸铵溶液，5ml氯化铵-氢氧化铵缓冲溶液。

③加入0.2%二乙氨基二硫代甲酸钠溶液5ml，静置2min。

④准确加入10ml四氯化碳，用力振荡不少于2min（若用振荡器振荡，应不少于4min）， 静置待分层。

⑤测量：用滤纸吸去漏斗颈部的水分，塞入一小团脱脂棉，弃去最初流出的有机相 1~2ml，然后将有机相放入20mm干燥的比色皿，于440nm处，以四氯化碳作参比， 测量吸光度。

⑥用50ml 水代替试样，按上述步骤同时进行空白试验，以试样的吸光度减去空白试 验的吸光度后，从校准曲线查出铜含量。

2.2.7.3 校准曲线

①八个125ml分液漏斗中，分别加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00、6.00ml 的铜标准使用溶液，加水至体积为50ml，配成一组标准系列溶液。

②按上述操作步骤进行显色萃取和测量，将测得的吸光度作空白校正后，再与相应的 铜含量绘制校准曲线。

2.2.7.4 计算

铜（Cu,mg/L）=m/V

式中，m－山校准曲线的铜量（μg）；

V－萃取用的水样体积（ml）。

2.2.7.5 标准曲线测定

根据上文所述标准曲线测定方法，测量获得测量数据。

表3-1. 标准曲线测定

图3-1. Cu² 标准曲线

获得标准曲线方程y=0.8396x-0.0034 R²=0.9967

第三章 结果与讨论

3.2 Cu² 浓度的影响

该次实验中Cu² 离子为唯一变量，实验温度37℃，培养基pH=7，成团泛菌接种量=1%

图3-1. 不同Cu² 浓度下，成团泛菌的随时间的生长情况

如图所示，成团泛菌的生长对数期在前10个小时，之后进入平稳期。而在Cu² 浓度不高于200mg/L的环境中，成团泛菌都能够良好的生长，前10小时内对数上升，之后进入平稳期。10mg/L实验中经过10小时对数增长，OD₆₀₀达到2.392，24小时OD₆₀₀为2.428。20mg/L实验中经过10小时对数增长，OD₆₀₀达到2.14，24小时OD₆₀₀为2.500。其中50mg/L生长的最好，10小时对数增长后，OD₆₀₀达到2.584，24小时OD₆₀₀为2.932。100mg/L实验中经过10小时对数增长，OD₆₀₀达到2.124，24小时OD₆₀₀为2.076。200mg/L实验中经过10小时对数增长，OD₆₀₀达到1.584，24小时OD₆₀₀为2.044。当Cu² 浓度高于300mg/L时，成团泛菌的生长明显受到抑制，菌株经过极4小时少量的增长后就不再增长。其中300mg/L实验中4小时时达到0.263，直到24小时也只增长到0.308。400mg/L实验组与300mg/L实验组所得数据几乎重合。

表3-1. 不同Cu² 浓度下的金属去除率

从表3-1中显示，金属去除率在10小时时达到最高。结合图3-1生长曲线可以看出，在10小时时成团泛菌生长开始进入稳定期。在表3-1中横向比较发现，Cu² 为100mg/L时，金属去除率最高，达到36.93%。其余几组中，200ml/L的去除率也达到35.55%，10、20、50、300ml/L这几组中去除率也都超过30%，其去除率峰值依次为32.38%，34.34%，33.40%，32.00%。400m/L中去除率峰值为26.24%，可见该浓度下成团泛菌生长开始受到抑制，去除率下降严重。故在后续其他变量实验中选用100mg/L作为定量。

3.3 接种量的影响

该次实验中接种量为唯一变量，实验温度37℃，培养基pH=7，Cu² 浓度为100mg/L

图3-2. 成团泛菌不同接种量下的生长情况

图3-3.成团泛菌在不同接种量下对Cu² 去除率

如图3-3显示，1%、2%和5%接种量实验中，去除率都在10h时达到最高，依次为49.75%，44.32%，40.51%而10%接种量的实验中，6h时就已经达到最高值。结合图3-3分析发现，10%接种量实验中，因为接种量较大，6h时已经进入平稳期，较另外三组更快达到其去除率最大值30.03%。而在图3-3中也可以看出，1%接种量的最大Cu² 去除率最高，达到49.75%。在有限的营养环境中，超过1%的接种量会使得去除率峰值下降。尤其在10%接种量中，峰值提早出现且只有30.03%的接种量。在后续实验选用1%接种量。

3.4 培养基pH对成团泛菌去除率的影响

图3-4. 成团泛菌在不同pH的培养基生长环境下的生长情况

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