抗虫害真菌绿僵菌的发酵培养基优化毕业论文
2022-05-30 10:05
论文总字数：22827字
摘 要
金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)是一类重要的昆虫病原真菌，它作为生物防治制剂具有环境安全性好和昆虫不易产生抗性等特点。此外，绿僵菌的寄主广泛性和广谱性使得其成为一种研究昆虫病原真菌侵染寄主过程的重要模式生物。目前，绿僵菌主要应用于防治地下害虫、天牛、蝗虫等，在已知的绿僵菌中，金龟子绿僵菌小孢变种和黄绿绿僵菌在防治经济作物害虫中应用最广。
本论文对绿僵菌属的分类、入侵寄主机理及绿僵菌生物农药等方面的现状进行了综述，对实验对象金龟子绿僵菌的发酵培养基进行了优化。在优化实验中，使用单因素法确定了几种对金龟子绿僵菌生长较有利的碳源、碳源和无机盐，将其作为考察对象，通过PB试验确定了其中影响最显著的三个因素，经过最陡爬坡实验，确定逼近金龟子绿僵菌发酵生物量最大化区域的培养基，最后使用响应面优化得到了金龟子绿僵菌的最优发酵培养基配方。研究结果如下：
优化培养基组分为：蔗糖20.07g/L，酵母膏20.04g/L，MgSO40.7g/L，在此培养基中，金龟子绿僵菌生物量可达到16.173g/L，比优化前提高了37.24%。
关键词：金龟子绿僵菌 单因素法 PB试验 最陡爬坡实验 响应面优化
The Optimization of Fermention Medium for Pest-resistant Fungi Metarhizium anisopliae
ABSTRACT
Metarhizium anisopliae is one of the most important genera of entomopathogenic fungi, it has a great potential as biocontrol agents due to its environmental safety and low likelihood of the development of insect resistance. Moreover, the wide occurrence and its broad spectrum of action make this fungus has been become a very important model organisms to study the infection process in arthropods. At present, Metarhizium anisopliae is mainly used in prevention and control of underground pests, stem borer, grasshoppers, etc.M.anisopoliae var.anisopliae and M.flavoviride are used most widely.
In this paper, the research on classifying status of Metarhizium spp., correlation gene in the breaking insect and the preparation of Metarhizium anisopliae in recent years are summarized, ang the fermention medium of Metarhizium anisopliae is optimized. The experiment uses single factor method to determine carbon source, nitrogen source and inorganic salts which are conducive to the growth of Metarhizium anisopliae, based which factors, through the PB experiment to determine the three most significant factors, uses climbing experiment to find out the culture medium which approach the maximize area of biomass, finally get the best culture medium formula of Metarhizium anisopliae using response surface analysis. The results are as follows:
The optimized medium composition is: sucroseg: 20.07g/L, yeast extract: 20.04g/L, MgSO4: 0.7g/L, respectively. In the optimized medium, the biomass of Metarhizium anisopliae reached 16.173g/L, 37.24% higher than that in the initial medium.
Key Words: Metarhizium anisopliae; single factor metho; PB experiment; The steepest climbing experiment; The response surface optimization
摘 要 I
ABSTRACT II
第一章 文献综述 1
1.1 生物农药简介 1
1.2 绿僵菌概述 1
1.2.1 分类现状 1
1.2.2 生物学特性 2
1.2.3 侵染机制 2
1.3 绿僵菌生物农药 4
1.3.1 生产工艺 4
1.3.2 剂型 4
1.3.3 商品化及应用 4
1.3.4 安全性 5
1.4 本课题的意义 5
第二章 金龟子绿僵菌发酵培养基优化 7
2.1 材料 7
2.1.1 菌种 7
2.1.2 培养基配置与灭菌方法 7
2.1.3 仪器与设备 8
2.1.4 试剂 8
2.2 方法 10
2.2.1 斜面种子活化培养 10
2.2.2 种子液制备 10
2.2.2 摇瓶培养 10
2.2.3 生物量的测定 10
2.3 实验设计 10
2.3.1 金龟子绿僵菌初始生长曲线测定 10
2.3.2 不同碳源的选择实验 11
2.3.3 不同氮源的选择实验 11
2.3.4 不同无机盐的选择实验 11
2.3.5 Plackett-Burman设计实验 11
2.3.6 最陡爬坡实验 12
2.3.7 响应面分析法 12
2.4结果与讨论 12
2.4.1 金龟子绿僵菌初始生长曲线 12
2.4.3 碳源对菌体生长的影响 13
2.4.4 无机盐对菌体生长的影响 14
2.4.5 Plackett-Burman设计实验筛选对菌体生长影响较显著的因素 15
2.4.6 最陡爬坡实验设计 16
2.4.7 响应面法优化发酵培养基配方 17
2.5 本章小结 23
第三章 结论与展望 24
3.1 结论 24
3.2 展望 24
致谢 28
文献综述
1.1 生物农药简介
生物农药是具有农药特性的生物活体及其产生的生理活性物质和转基因产物，用来防治病、虫、草等有害生物的。包括微生物农药、农用抗生素、植物源农药、生物化学农药、转基因生物农药和天敌生物农药。与传统的化学农药相比，生物农药对人畜和非靶标生物安全，环境兼容性好，不易产生抗性，有利于保护生物多样性，而且来源广泛。高效生物农药的开发应用对人类健康、环境保护和农业的可持续发展都有重要意义[1]。
1.2 绿僵菌概述
绿僵菌(Metarhizium anisopliae)分类地位隶属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科[2]，是一种有效的杀虫真菌，利用它来防治害虫的研究与实践已有百年的历史[3]。据不完全统计，全世界约有200多种昆虫能被绿僵菌感染致死[4-5]，另外，它致病力强，效果好，对人，畜，作物无毒害，是当前世界上研究和应用最多的虫生真菌之一，利用绿僵菌防治害虫具有广阔的前景。中国研究开发绿僵菌起步晚，但经过多年的研究开发在菌株选育、生产工艺、剂型和防治对象上已有进步。目前，重庆大学基因研究中心完成了杀蝗绿僵菌生物农药的研制，取得了重要的研究成果，生产的产品已在国内多个省份示范试验。
1.2.1 分类现状
1883年，Sorokin根据模式种金龟子绿僵菌(M.anisopliae)建立绿僵菌（Mitarihzium），目前发表十余个种。1967年Tulloch对此属的系统研究[6]，把本属归为2个种，包括金龟子绿僵菌和黄绿绿僵菌，金龟子绿僵菌包括小孢变种和大孢变种。1986年，Rombach等进一步将黄绿绿僵菌分为黄绿绿僵菌小孢变种(M.flavoviride var.minus)和黄绿绿僵菌大孢变种(M.flavoviride var.flavoviride)[7]。我国学者郭好礼等曾发表过3个新种:平沙绿僵菌(M.pingshaensisChenamp;Guo)、贵州绿僵菌(M.guizhouensisChenamp;Guo)和柱孢绿僵菌(M.cylindrosporaeChenamp;Guo)[8],1989年被刘爱英等组合为双型绿僵菌(M.biformisporae(Chenamp;Guo)Liangamp;Liu)[9,10]。戴宗琦等将从虫草新种戴氏虫草(CordycepstaiiLiangamp;Liu)上分离的绿僵菌命名为新种戴氏绿僵菌(M.taiiLiangamp;Liu),并用微循环产孢的方法证明这种绿僵菌与虫草属之间的无性型和有型关系。目前我国普遍承认6种（包括变种）绿僵菌。(1)金龟子绿僵菌[M.anisopliae(Metsch.)Sorokinvar]，金龟子绿僵菌被Tulloch分为2个变种:金龟子绿僵菌小孢变种(M.anisopliae var.anisopliae)和金龟子绿僵菌大孢变种(M.anisopliaevar.majus)；(2)黄绿绿僵菌(M.flavoviride Gamsamp;Rozsypal)；黄绿绿僵菌分为2个变种:黄绿绿僵菌小孢变种(M.flavoviride var.minus)和黄绿绿僵菌大孢变种(M.flavoviride var.flavoviride)；(3)双型绿僵菌(M.biformisporae(Chenamp;Guo)Liangamp;Liu)；(4)戴氏绿僵菌(M.taiiLiangamp;Liu)。
在已知的绿僵菌中，金龟子绿僵菌小孢变种（M.anisopoliae var.anisopliae）和黄绿绿僵菌（M.flavoviride）在防治经济作物害虫中应用最广[11]。
1.2.2 生物学特性
金龟子绿僵菌PDA及查氏培养基上菌落呈绒毛状至棉絮状，初为白色，产孢时为橄榄绿色。菌丝具分隔和分支，透明，直径为1.5~2μm。其分生孢子梗直径约2微米，很难与菌丝区别，其末端产生瓶形小梗，大小为（6~25）μm×（1.5~2.2）μm。分生孢子为单细胞，长椭圆形至长柱状，两端钝截形或钝圆，大小变化甚大，（5~9）μm×（2~4.5）μm。
1.2.3 侵染机制
绿僵菌对寄主的入侵是寄主与病原菌之间生理生化作用的综合结果[12],可通过体壁、气门、消化道等多种途径侵染宿主，其中体壁途径是主要方式，这种侵染方式体现了真菌的特点。绿僵菌侵染过程一般可分为9个阶段：①分生孢子附着昆虫表皮；②感染性单位，即孢子在表皮上萌发。这一过程需要较高的温度；③穿透表皮。分生孢子萌发形成的芽管直接穿透昆虫表皮或形成附着胞牢固的附着在昆虫表皮上，然后从附着胞上产生细长的侵入丝深入表皮[13]。这一过程是由芽管萌发生长时产生的机械压力和其在生长过程中分泌的相关酶的联合作用下共同完成[14-16]。分泌的酶可降解体壁中的蛋白质和几丁质等物质，从而使孢子萌发的芽管得以穿透体壁；④菌丝在体腔内生长；⑤产生毒素。许多虫生真菌在广泛侵入寄主之前就战胜了寄主的保卫反应，有研究认为是毒素起了重要作用，已知毒素多为小分子缩羧肽及蛋白酶类；⑥寄主死亡；⑦菌丝在寄主体内大量繁殖，侵入寄主的所有器官，最终使虫体僵硬；⑧菌丝从寄主体内穿出；⑨产生新的感染单位并发生扩散[17-18]。
绿僵菌的入侵是机械压力和酶共同作用的结果。在入侵体壁前存在一个对营养的选择作用，可能造成物理压力，迫使菌体入侵内含丰富营养物质的虫体；另一方面，绿僵菌分泌的酶能消解表皮，打通通道，同时提供营养，从而使侵染得以成功。目前的研究表明，绿僵菌在入侵昆虫体壁的过程中，能够分泌的酶有蛋白酶、几丁质酶、脂酶、酯酶和淀粉酶等[19]。EL-Sayed等发现无论在萌发还是菌丝生长过程中都存在着酶对表皮的降解[20]；St. Leger等发现酶的活性随菌株生长过程中附着孢的大量出现逐渐增强[21]，表明酶是绿僵菌入侵的重要因子。
蛋白质是昆虫表皮的主要组成部分，因此，蛋白酶在绿僵菌入侵过程中发挥着重要作用。目前已经知道绿僵菌能产生一系列的胞内、外蛋白酶，在St. Leger等的研究中，认为绿僵菌内切蛋白酶有Pr1、Pr2和Pr3三类[22]。Pr1链上的一些位点能与昆虫表皮中的谷氨酸和天冬氨酸的羧基相结合，在适当的条件下，结合位点被激活，蛋白质链断裂为多肽，多肽链继续降解直至达到5肽。Pr2是一种胰蛋白酶，St Leger等的研究认为，Pr2可能在Pr1的诱导激活方面发挥着重要作用[23]。St Leger等认为绿僵菌入侵过程中产生的外切蛋白酶主要是氨肽酶，氨肽酶单独对表皮不起作用，但与Pr1共同作用时，可继续降解Pr1的酶解产物，外切Pr1酶解产生的5肽，从而提高酶解氨基酸的含量[24]。几丁质是大多数甲壳类昆虫外骨骼的主要成分，目前的研究基本上都认为绿僵菌产生的几丁质酶是一种诱导酶[25]，它受到本身的酶解产物N-已酰葡萄糖胺的诱导-抑制作用。
绿僵菌还能分泌5种绿僵菌破坏素A、B、C、D、E，即环状缩梭肤类物质。绿僵菌破坏菌素是第一个被系统研究的环状缩梭肤类昆虫病原真菌毒素，其中破坏菌素A和E杀虫活性最强。破坏菌素对寄主昆虫具有免疫协迫活性，细胞毒性和细胞抑制活性，并能引起昆虫神经中毒及肌肉麻痹阴[26].，也关系菌株毒力的高低[27]，它们能降低寄主血细胞的功能和血淋巴中酶的活性。破坏菌素作为免疫抑制因子，能够限制和削弱寄主的正常防御反应，最终导致昆虫死亡。
另外，绿僵菌能产生一种吲哚类的衍生物——苦豆素，这种物质是一种免疫调节剂。绿僵菌产生的细胞松驰素不仅在生物学研究中可制备无核细胞，它在降低寄主昆虫血淋巴中巨噬细胞活动能力及被囊化作用上也很有意义。
1.3 绿僵菌生物农药
1.3.1 生产工艺
绿僵菌的生产工艺主要是固体发酵、液体发酵及液固双相发酵等3种方式生产。其中，绿僵菌双相发酵工艺是迄今国内外最成熟的生产工艺，发酵过程包括液体发酵和固体发酵两个阶段，其生产和技术系统都是采用两步培养方式，即通过摇瓶或发酵罐发酵快速产生大量菌丝或芽生孢子，然后转接到固体培养基或惰性基质上生产孢子[28-31]。单独由液体发酵产生的芽生孢子由于寿命短且生活力弱而在使用方面受到限制[32] 。干菌丝的研制为液体发酵产物的应用提供了新的应用空间。本实验即通过优化液体发酵培养基以得到发酵生产菌体最多的培养基配方。
1.3.2 剂型
到目前为止，真菌杀虫剂剂型主要有粉剂、可湿性粉剂、油剂、干菌丝、微胶囊、颗粒剂、漂浮剂等。其中，已大面积应用的绿僵菌剂型主要是粉剂、干菌丝和油剂。
粉剂：直接将分生孢子粉与一定填充料或添加物的混合而制成的产品。填充料的pH及其缓冲能力、对化学抑制性物质的吸收能力及对微生物的优化能力都是影响粉剂中孢子存活率的主要因素[33-34]。
油剂：以油为稀释剂，将分生孢子制成孢悬液的制剂。油剂在相对湿度很低的环境中利于孢子萌发，在高温环境下又能延长孢子的寿命，还有利于孢子吸附疏水基质，如昆虫体壁或植物表面。
干菌丝：为液体发酵产物提供了新的应用空间，丰富了真菌杀虫剂的剂型，在解决干菌丝制备的一些瓶颈问题后，该剂型应该得到较为广泛的应用[35]。
混合制剂：对真菌杀虫剂来说，杀虫速度较慢是其使用受到限制的一个重要因素。为了克服这个缺点，人们将化学杀虫剂、植物源杀虫剂及其它生物杀虫剂与绿僵菌制剂混合以取得更快的杀虫效果。
1.3.3 商品化及应用
目前国外研究的真菌生防制剂100多种，其中主要是真菌杀虫剂。全世界已登记注册的真菌杀虫剂51个，其中绿僵菌17 个。
绿僵菌制剂从生产试验到商品化，最成功的是英国蝗虫生物防治国际合作项目组(CABI Bioscience)研制的杀蝗绿僵菌生物农药，已在非洲注册登记、投产，大面积用于沙漠蝗的防治，施药10-15d后防效达到90%以上，成为有效的蝗虫生防手段。此外，澳大利亚蝗虫生物防治研究项目(CSIRO)研制出了杀蝗绿僵菌生物农药，用于大面积防治草原蝗虫；美国EcoScience绿僵菌产品(Bio-Path，Bio-Blast)用于防治蟑螂、白蚁；巴西和委内瑞拉的绿僵菌产品(Metaquino，Cobican)用于防治甘蔗沫蝉等。
真菌制剂作用缓慢，用适当的化学杀虫剂与真菌混配的做法一直广受重视。必要时绿僵菌复和制剂可客服绿僵菌制剂作用缓慢的缺点，快速发挥作用，避免损失，而又可发挥绿僵菌触发性和可持续作用的优点。目前绿僵菌灭白蚁、蝗虫的方法已经作为国家重点推广应用项目，可广泛应用于农田、林木、桥梁等多个领域的防治工作。
真菌杀虫剂绿僵菌是触杀性杀虫剂，且具广谱杀虫作用，利用其防治地上(地下)害虫，既经济又不污染环境，推广使用后取得显著的生态效益。但由于使用量较大、生产成本相对较高，分生孢子存活率低，贮存期短等缺点，尚需进行深入研究。
1.3.4 安全性
联合国粮农组织（FAO）研究表明:绿僵菌对人类和其它哺乳动物无害，于1997将绿僵菌推荐为环保产品推广应用。目前为止，国外已有10多个杀蝗绿僵菌菌株对环境的安全性被测试，结果表明，绿僵菌对环境友好，不杀伤非目标生物。
在塞内加尔试验表明,蝗虫绿僵菌对晰蝎无影响。Smits et al.用被IMI330189侵染的蝗虫给鸟喂食，没有发现任何毒副作用，说明绿僵菌对鸟类安全。董辉等人[36]结合天敌对感染昆虫的取食变化以及绿僵菌对天敌个体及天敌种群动态的影响进行研究表明：感染绿僵菌的蝗虫无论是单独存在，还是与生理正常的蝗虫混合存在，蝗虫天敌步甲均不对其进行取食；绿僵菌对步甲、芫菁、虎甲等天敌个体并没有出现致病作用。
1.4 本课题的意义
化学农药效果显著，但对环境的污染严重，且存在害虫抗药性和安全性问题。如今，随着人们环境保护和食品安全的意识不断增强，人们对害虫生物防治的研究和应用也日渐加强，昆虫病原真菌是当前国内外害虫生物防治研究生产和应用最多的生物类群之一。真菌杀虫剂具有对环境安全无污染、对害虫不易产生抗性和可扩散流行等优点，是国内外生物防治的重点研究对象。本课题将进行绿僵菌的培养基优化，将为绿僵菌制剂的规模化生产提供基础。
金龟子绿僵菌发酵培养基优化
发酵培养基的优化对微生物发酵的产量具重要影响，设计合适的发酵培养基，是微生物发酵成功的重要一步。微生物发酵是微生物复杂的代谢过程，一般情况下，其培养基组分繁多且各成分间还可能存在错综复杂的交互作用。因此，采用合适的方法对微生物培养基的进行优化就显得尤为重要。
本章以实验室保藏的金龟子绿僵菌为研究对象，对其摇瓶发酵培养基进行初步研究，分别考察了氮源、碳源、无机盐对菌体生长的影响，并通过PB试验，最陡爬坡实验及响应面分析确定最优的液体发酵培养基。
2.1 材料
2.1.1 菌种
本实验室筛选并保藏的金龟子绿僵菌。
2.1.2 培养基配置与灭菌方法
斜面培养基：PDAY培养基，即马铃薯200g，洗净去皮切碎，加水煮沸30min，纱布过滤，加入蔗糖20g，酵母膏5g，琼脂18g，用去离子水定容至1L，摇匀并分装到500mL的三角瓶中，每瓶250mL，121℃灭菌20min后趁热分装试管，分装量占斜面体积的1/4，摆斜面，冷却后贮存备用。
初始发酵培养基：蔗糖20g，酵母膏10g，磷酸二氢钾5g，七水硫酸镁2g，用去离子水定容至1L，1mol/L硫酸调pH至6.5。分装到500mL的三角瓶中，包扎，121℃灭菌20min。
2.1.3 仪器与设备
在本实验中所用到的仪器见表2-1。
表2-1 主要实验设备
Table 2-1 The main equipments
实验设备 | 型号 | 厂家 |
恒温摇床 | ET-25-TA-RC | INFORS |
灭菌锅 | HVE-50 | HIRAYAMA |
台式高速大容量离心机 | 5810R | Eppendorf |
数显鼓风干燥箱 | GZX-9030MBE | 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 |
电子天平 | BSA224S | Sartorius |
pH计 | Cole Parmer | Cole Parmer Instrument Co. |
超净工作台 | SW-CF1F | 苏州净化设备厂 |
恒温培养箱 | PYX-DHS 400BS-Ⅱ | 上海跃进医疗器械有限公司 |
光学显微镜 | CX31 | OLYMPUS |
2.1.4 试剂
在本实验中所用到的试剂见表2-2。
表2-2 主要试剂
Table 2-2 The main reagents
试剂名称 | 级别 | 生产厂家 |
马铃薯 | 食品级 | 市售 |
蔗糖 | 分析纯 | 西陇化工股份有限公司 |
酵母膏 | 生化试剂 | 国药集团化学试剂有限公司 |
琼脂粉 | 生物试剂 | 北京奥博星生物技术有限责任公司 |
吐温80 | 分析纯 | 上海凌峰化学有限公司 |
去离子水 | — | — |
甘油 | 分析纯 | 中国医药上海化学试剂公司 |
葡萄糖 | 分析纯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
乳糖 | 分析纯 | 成都市科龙化工试剂厂 |
甘油 麦芽糖 可溶性淀粉 蛋白胨 牛肉膏 硝酸钠 甘氨酸 硫酸亚铁 硫酸镁 氯化钠 磷酸二氢钾 请支付后下载全文，论文总字数：22827字
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