人肺癌耐药细胞株的建立毕业论文
2022-04-06 09:04
论文总字数：15419字
摘 要
建立人肺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol，并且描述亲本细胞株和耐药细胞株的生物学特性。为后期耐药机理的进一步研究提供理论依据。
用抗癌代表药紫杉醇以逐步递增浓度，间歇作用体外诱导法建立获得性耐药细胞株A549/Taxol；MTT法检测耐药细胞株的耐药指数；在倒置显微镜下观察亲本细胞株和耐药细胞株在药物作用前和作用后的细胞形态学变化；细胞计数法描绘亲本和耐药细胞株的生长曲线和群体倍增时间；流式细胞仪分析亲本细胞株和耐药细胞株的周期分布。细胞建立完成后，对其进行IC50的测定，以耐药倍数达10倍以上为最佳。
通过浓度递增诱导法历时3个月成功构建人肺癌紫杉醇耐药株。①MTT法测定结果显示，耐药株细胞的耐药指数（RI）44.63。②显微镜下观察结果显示，与亲本细胞相比，紫杉醇耐药细胞株细胞形态排列比较整齐，细胞呈长梭型，而亲本细胞则呈不规则的多角形。③在倍增时间方面，结果显示亲本细胞为1.64天，耐药细胞株为2.52天。④流式周期检测显示，相比亲本细胞周期，诱导耐药株细胞S期明显升高。
成功建立人肺癌紫杉醇耐药细胞株A549/Taxol，而且该耐药细胞株耐药性稳定，该实验结果可以为进一步研究其耐药机制，筛选有效的人肺癌化疗药物及逆转剂提供可靠的实验模型。
关键词：紫杉醇、耐药细胞株、体外诱导、耐药倍数、建立
Abstract
Establish paclitaxel resisitant lung cancer cell lines A549/Taxol,and describe the biological characteristics of parental cell lines and drug resistant cell lines.To provide theoretical basis for the further study of the mechanism of drug resistance.
With anti-cancer representative drug taxol to gradually increasing concentration.Intermittent function derivation based acquired drug resistance cell lines A549/Taxol in vitro;Determined by MTT method to detect drug resistant cell lines resistant index;Were observed under inverted microscope and cell lines before and after drug resistant cell morphology;Cell counting method depicted resistant and parental cell lines and group doubling time of growth curve;Flow cytometry instrument analysis of the cell cycle distribution.After the completion of the cells,for the determination of IC50,resistance to multiples of more than 10 times as the best.
By high concentrations of repeated intermittent candidated lasted 3 months successful build people lung cancer drug resistant strain.Determined by MTT method,according to the results of cell resistant strains resistant index (RI) of 44.63. Microscope results showed that compared with the parental cells, drug resistance cell line cells form is neat, cells are long shuttle type, while parental cells showed irregular polygon. In terms of doubling time, results showed that parental cells was 1.64 days, drug resistant cell lines was 2.52 days.④Flow cycle test showed that compared to the parent cell cycle, inducing cell resistant strains S period increased significantly.
Successfully establish paclitaxel resisitant lung cancer cell line A549/Taxol,the
drug-resistant cell line resistance stability,with basic biological characteristics of drug-resisitant cells.The experimental results could be used to further study the drug
resistance mechanism screening effective human lung adenocarcinoma of the chemotherapy drugs and reversal agents provide a reliable experimental model.
Key words：Taxol;Resistant cell line;Induction in vitro;Resistance index;Establish
目录
第一章 文献综述 1
1.1背景 1
1.2紫杉醇的性质和药理 1
1.3建立耐药细胞株的方法 2
1.4检测细胞耐药性 2
1.5拟采用的研究方法 3
第二章 实验方法 4
2.1材料 4
2.1.1细胞来源 4
2.1.2主要试剂 4
2.1.3主要仪器与耗材 4
2.2方法 5
2.2.1细胞复苏 5
2.2.2细胞培养 5
2.2.3细胞消化和离心 6
2.2.4细胞计数 6
2.2.5细胞接种 6
2.2.6细胞传代和冻存 7
2.2.7给药 7
2.2.8 MTT检测 8
2.2.9耐药株A549/Taxol的建立 8
2.2.10细胞生长曲线的绘制 9
2.2.11流式细胞术检测周期分布 9
第三章 实验结果与讨论 10
3.1细胞形态学观察 10
3.2耐药细胞株耐药敏感性测定 12
3.3细胞生长曲线测定 13
3.4流式细胞仪检测细胞周期的变化 14
3.5讨论 15
参考文献 17
第一章 文献综述
1.1背景
肺癌严重威胁人类生命与健康，其发病隐匿，进展迅速，约2/3的患者确诊时已失去了手术机会，目前，肺癌的治疗方法主要以手术切除为主，术后辅以化疗药物治疗[1]。即使如此，仍有大部分患者出现术后复发，导致治疗失败，究其原因主要是肺癌细胞对化疗药物的耐药性特别是多药耐药性（MDR）[2]。各项研究表明，肿瘤细胞药物耐受包括原发耐药和诱导耐受，前者是指肿瘤细胞在治疗的开始阶段就对抗肿瘤药物产生了耐药性，后者则是在化疗过程中肿瘤细胞对抗肿瘤药物产生耐药性，两者涉及的生理机能可能极为相似，原发性耐受因为没有敏感细胞作比较，所以难以进行研究[3]。而诱导耐受能在体外经短期或长期诱导获得，并且有敏感细胞作参照，比较容易对比研究。因此，人们一直努力建立细胞的耐药模型，为筛选有效的人肺癌细胞耐药逆转剂提供实验基础[4]。
1.2紫杉醇的性质和药理
常用的抗癌药有长春新碱、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、依托泊苷、阿霉素。其中紫杉醇是美国百时美-施贵宝公司开发的一个全新植物抗癌药[5]。它是一种在红豆杉科（Taxaceae L.）红豆杉属（Taxus L.）生长缓慢的常绿乔木中分离提取到的天然化合物，1993年10月首次在美国上市，国内首次上市的时间为1995年，属于抗微管一类的抗癌药，是目前世界上公认的疗效最好并且抗癌谱最广的药物之一，对肺癌的治疗效果很显著[6]。它作用的药理是细胞在接触紫杉醇后，细胞内会积累大量的微管，这些微管的积累会导致细胞的各种功能被干扰，尤其是会使细胞分裂在有丝分裂期停止，阻断细胞的正常分裂[7]。紫杉醇的这种独特的药理作用加快了其临床研究的步伐，1982年Ⅰ期临床试验开始，1989年就完成了Ⅱ期临床试验，并于1990年进入Ⅲ期临床试验，并证实了对卵巢癌和乳腺癌的疗效[8]。经过多年的不断研究，发现紫杉醇对许多不同类型的癌症都有不同程度的疗效，尤其是严重威胁人类健康的肺癌[9]。另外，紫杉醇的改良版多西紫杉醇是是对紫杉醇进行结构修饰改造得到的，是迄今研究发现的疗效最显著的抗癌药物之一，以及它的抗癌活性是紫杉醇的十倍，并且具有广谱的抗白血病和抗体体肿瘤活性，已经成为世界抗癌研究领域关注的焦点[10]。
1.3建立耐药细胞株的方法
目前，国内外学者利用冲击诱导法、浓度递增诱导法、或者结合两法使用等方法在体外建立了多种肿瘤耐药细胞系[11]。人肺癌耐药细胞株的建立的方法也可使用上述方法，①冲击法结合浓度递增法，将浓度递增诱导法与冲击诱导法相结合，测定人肺癌A549细胞对紫杉醇的最低耐受浓度后，用一个确定的终浓度紫杉醇培养液培养人肺癌A549细胞24小时后，之后更换培养液，用含相同浓度的紫杉醇培养液培养7天，细胞稳定生长后传代，再次用含终浓度的紫杉醇培养液培养细胞24小时，更换新的含较高浓度的紫杉醇培养液培养7到10天，待细胞稳定生长后传代，之后逐渐增加紫杉醇浓度，每次增加浓度前都要用终浓度的紫杉醇培养液培养24小时，最终使A549细胞能在一个确定的浓度紫杉醇培养液中稳定生长和传代[12]。②浓度递增诱导法，使用小剂量的含紫杉醇的培养液培养生长密度达到80％～90％的人肺癌A549细胞，因为经过紫杉醇的破坏，存活的细胞生长会比一般正常细胞缓慢，并且细胞会大部分死亡、待细胞的生长活性和倍增时间恢复至之前一样的状态后，再增加紫杉醇的剂量，直至确定细胞能在一定浓度的紫杉醇培养液中稳定生长，最终获得耐药细胞株[13]。③冲击诱导法，用含终浓度的紫杉醇培养液培养冲击处于对数生长期的人肺癌A549细胞，培养1小时后弃去含药培养液，经PBS冲洗、胰酶消化后，以一定细胞浓度接种于不含药的新培养瓶中，第二天仍用不含药培养液换液，待细胞长至培养瓶的70%～80%时再次用含药培养液冲击，同种方法冲击多次，抗药性检测同时进行，反复冻存、复苏，观察细胞的形态学变化及其稳定性，最终得到耐药细胞株[14]。
1.4检测细胞耐药性
获得耐药细胞株后需要检测它的耐药性，以此来检验实验成败与否。常用的有MTT法、CCK-8法、SRB法。实验中最常用的是MTT法，MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，商品名为噻唑蓝，是一种外表为黄颜色粉末状的染料。MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活率的方法[15]。其检测的原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），并且甲瓒会沉积在细胞中，而死细胞则没有这种功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞的数量，测出的OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比[16]。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。MTT法的优点就是灵敏度高，且能准确的反映出活细胞的数量，从而知道药物不同浓度下对细胞的抑制率，而且经济实惠，性价比高。
1.5拟采用的研究方法
本课题以人肺癌A549为靶细胞，紫杉醇为诱导药物。拟采用浓度递增诱导法，即使用小剂量的含紫杉醇的培养液培养生长密度达到80％～90％的人肺癌A549细胞，经过紫杉醇的破坏，存活的细胞生长会比一般正常细胞缓慢，并且细胞会大部分死亡、待细胞的生长活性和倍增时间恢复至之前一样的状态后，再增加紫杉醇的剂量，直至确定细胞能在一定浓度的紫杉醇培养液中稳定生长，最终获得耐药细胞株。拟选用MTT法检测细胞的耐药倍数，并用流式细胞仪检测亲本细胞株和耐药细胞株的周期分布。A549/Taxol的建立对今后研究肺腺癌的多药耐药机制具有一定的应用价值，也为体外筛选化疗药物及研究耐药逆转剂提供基础，并为其临床应用提供理论依据[17]。
第二章 实验方法
2.1材料
2.1.1细胞来源
人肺癌细胞株A549由江苏凯基生物技术股份有限公司提供。
