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摘 要

背景 骨肉瘤是成骨性恶性肿瘤最多见的一种，目前所有的治疗方法均存在一定的缺陷，手术切除病灶后产生的骨缺损和全身化疗带来的毒副作用均没有得到完美的解决，再加上术后复发对患者生存造成极大威胁。

目的 本课题计划制备了一种同时兼备骨功能和抑制肿瘤功能的新型材料——载阿霉素脂质体nHA-PCL支架，并对其理化性质、释药特点以及细胞毒性进行相关检测，为临床骨肉瘤的治疗提供新的方法。

方法 采用硫酸铵梯度法制备阿霉素脂质体，通过3D打印技术以纳米羟基磷灰石（HA）和聚己内酯（PCL）混合物为原材料制备nHA-PCL支架，并借助聚多巴胺将阿霉素（ADM）脂质体与支架结合，获得载阿霉素脂质体nHA-PCL支架。在体外通过透析袋扩散法和制备浸提液进行材料的药物释放性实验和细胞毒性实验。

结果 我们课题成功制作了一种新型材料——载阿霉素脂质体nHA-PCL支架，其中载药脂质体的粒径在152 ± 5.4 nm，多分散系数PDI lt; 0.198，且包封率为92.45 ± 2.1 ％。释药曲线研究证明该材料具有较好的释药效果——缓慢长效和没有明显的突释情况。采用CCK-8法证明，该材料其浸提液在24小时内明显抑制MG 63人骨肉瘤细胞的生长，并且抑制作用和浸提液浓度之间呈正相关性。

关键词：阿霉素脂质体 nHA-PCL支架 骨肉瘤

Physicochemical properties and cytotoxicity of doxorubicin-loaded liposome nHA-PCL scaffold

Abstract

Background Osteosarcoma is the highest incidence of osteogenic malignancies.At present,all the treatment methods have certain defects.The bone defects caused by surgical removal of the lesion and the side effects caused by systemic chemotherapy have not been solved perfectly.Postoperative recurrence poses a great threat to the survival of patients.

Objective This study plans to prepare a novel material that combines bone function and tumor function with the doxorubicin-loaded liposome nHA-PCL scaffold, and correlates its physical and chemical properties, drug release characteristics and cytotoxicity. The treatment of clinical osteosarcoma provides a new approach.

Methods Doxorubicin liposomes were prepared by ammonium sulfate gradient method,and nHA-PCL scaffolds were prepared by a mixture of nano-hydroxyapatite （HA） and polycaprolactone （PCL） as raw materials by 3D printing technology,and doxorubicin （ADM） was treated with polydopamine.The liposome is bound to the scaffold to obtain a doxorubicin-loaded liposome nHA-PCL scaffold. The drug release test and cytotoxicity test of the material were carried out in vitro by a dialysis bag diffusion method and a preparation of the extract.

Result The doxorubicin-loaded liposomal nHA-PCL scaffold was successfully prepared. And the prepared doxorubicin liposome had a particle size of 152 ± 5.4 nm, a polydispersity coefficient of PDI lt; 0.198,and an entrapment efficiency of 92.45 ± 2.1 %.The release curve study proves that the material has a good release effect - slow long-acting and no obvious burst release.The CCK-8 method proved that the extract of this material obviously caused the death of MG 63 human osteosarcoma cells within 24 hours, and there was a direct relationship between the concentration of the extract and the lethal effect of the tumor cells.

Key Words： Doxorubicin liposome; nHA-PCL; Stent osteosarcoma

目 录

摘要

Abstract

第一章 前言

1.1 骨肉瘤

1.1.1 化学疗法

1.1.2 外科手术法

1.1.3 新辅助治疗法

1.2 阿霉素脂质体

1.3 HA-PCL支架

1.4 研究方法及目的

第二章 实验材料与方法

2.1 实验试剂与仪器

2.1.1 实验试剂与材料

2.1.2 实验仪器

2.2 阿霉素脂质体制备及粒径测定

2.3 nHA-PCL支架制备

2.4 载阿霉素nHA-PCL支架制备

2.5 系统适应性实验

2.5.1 二甲基亚砜标准曲线的制备^[25]

2.5.2 阿霉素DMSO溶液精密度和准确度的测定与回收率的计算

2.5.3 PH=7.4 PBS缓冲液标准曲线的制备

2.5.4 阿霉素PBS溶液精密度和准确度的测定与回收率的计算

2.6 包封率

2.7 释药曲线

2.8 载阿霉素nHA-PCL支架的细胞毒性实验

2.8.1 材料浸提液的制备^[27]

2.8.2 浸提液的MG 63细胞生长抑制试验

第三章 结果与讨论

3.1 系统适应性实验

3.1.1 二甲基亚砜标准曲线

3.1.2 阿霉素DMSO溶液精密度和准确度的测定与回收率的计算

3.1.3 PH=7.4 PBS缓冲液标准曲线

3.1.4 阿霉素PBS溶液精密度和准确度的测定与回收率的计算

3.2 阿霉素脂质体表征（粒径与包封率）

3.3 释药曲线

3.4 载阿霉素nHA-PCL支架的细胞毒性

第四章 结论

参考文献

致 谢

前言

骨肉瘤

骨肉瘤是一种发病率较高的成骨性恶性肿瘤，发病期在人类青少年11-20岁左右^[1]，发生部位在长骨干骺端，比如肱骨近端、股骨远端。有研究^[2]表明，男性的发病率约为女性的1.28倍。自20世纪70年代化疗代替手术进行治疗以来，骨肉瘤患者的5年生存率从不到20 ％提升至80 ％左右。近三四十年以来现代医学不断发展，骨肉瘤的各种治疗方法逐渐进步，但因放疗敏感性差，所以骨肉瘤的临床治疗方法仍以手术和化疗为主。

化学疗法

在骨肉瘤的治疗中，化学疗法依旧占据非常重要的地位。Bernthal等学者^[3]证明了这一点，经过25年的跟踪随访，化疗的试验组比未经治疗组不仅5年无病生存率高13 ％，甚至总生存率高23 ％，且在统计学方面实验数据存在意义（P lt; 0.05）。随着不断研究发明新的靶向药物和化疗药物，异环磷酰胺（IFO）、甲氨喋呤（MTX）、顺铂（DDP）及阿霉素（ADM）等成为临床上较为常用化疗药物，但化疗效果最好的药物依旧是传统的细胞毒性药物，如顺铂，阿霉素等。

外科手术法

外科手术一直是治疗骨肉瘤原发灶的主要手段。早期外科手术以截肢为主，这对患者身心造成了一定的伤害。后来随着手术技巧、骨修复、药物合成等治疗方法的进步，保肢治疗逐渐成为主要治疗手段，但依旧面临许多问题，例如术后发现存在残存部分的肿瘤组织未切除干净；在切除肿瘤病灶的同时切除了负重骨骼；肿瘤复发率和并发症发生率较高^[4]。

新辅助治疗法

目前国际公认的是自上世纪80年代起的新辅助治疗法，其治疗模式为“辅助化疗 肿瘤手术切除”，它不但可以清除术后残存肿瘤组织，同时可以使患者的生存质量显著上升，明显提高患者的5年生存率至70 ％左右^[5]。鲁大路等^[6]对48例骨肉瘤患者分别使用新辅助治疗法（实验组）和截肢术 术后辅助化疗法（对照组）进行治疗，追踪发现实验组的肢体功能优良率和生存质量更高，且在统计学方面实验数据存在意义（P lt; 0.05）。

阿霉素脂质体

阿霉素是1967年从白链霉菌1号突变体中分离出来的一种蒽环类抗生素，抑制多种恶性肿瘤生长。它通过插入DNA双链，改变碱基对种类，导致DNA半保留复制机理错误。此外，它还可以通过拓扑异构酶Ⅱ阻止DNA链的断裂和结合，导致DNA超螺旋结构松弛从而有效减少肿瘤细胞数量^[7]。阿霉素和其他抗癌药物相同，会产生一定的细胞毒性。通过静脉注射阿霉素后，人体会立即产生急性副作用，包括：体重减轻、骨髓血细胞活性下降、窦性心律不齐、呕吐、脱发等症状。一旦停药，症状就会渐渐消失，对临床给药和抗癌细胞生长没有太大影响^[8]。在周期性使用阿霉素一段时间后会表现出慢性毒性，导致不可逆的心脏、肝脏、大脑和肾脏损伤^[9]，并且心脏毒性与阿霉素累积剂量相关，当累积剂量超过550 mg/m²体表面积时，心力衰竭发生率显著增加^[10]，而人类目前对其毫无办法。

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