固定化酶法生产L-2-氨基丁酸的可循环生物转化系统

Gang Xu . Yu Jiang . Rongshen Tao .

Shengfeng Wang . Hongyu Zeng . Sheng Yang

客观的 目的使已开发的L-2-氨基丁酸(L-ABA)生物合成工艺更适合工业化生产。

结果 开发了基于固定化酶技术的可回收生物转化系统。 利用优化后的苏氨酸脱氨酶的个体固定化和L-亮氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶的共固定化的生物转化体系，L-苏氨酸(90 g )的转化率达到99.9%，L-ABA的理论产率达到90.0%以上。在30批转化实验中，在120-145分钟内，90克L-苏氨酸转化为73.9gL-ABA[95%理论产率]。

结论:可循环生物转化系统有望满足L-ABA生产的工业要求.

关键词：L-2-氨基丁酸、脱氨、加氢、固定化、L-苏氨酸。

介绍：

L-2-氨基丁酸（L-ABA），是一种非自然氨基酸，已被用作合成许多手性药物的前体，像乙胺丁醇和被用作结核病治疗的布瓦西坦和用作抗癫痫的左乙拉西坦（Shin和Kim 2009；TayLor等人。1998年；Zhu等人。2011年)。为了生产L-ABA已经开发了许多基于酶的合成工艺.(TayLor等人，1998年；Park等人，2010年；Seo等人，2012年)。

L-ABA的合成可以是由2-氧代丁酸与L-天冬氨酸（或联苯胺）发生转胺化，也可以是通过亮氨酸脱氢酶或谷氨酸脱氢酶还原酮丁酸。（ Fotheringham等，1999年；Shin和Kim2009；Krix等人，1997；Zhang等，2010)。L-苏氨酸与L-天冬氨酸的转胺反应只得到58% —62%的L- ABA，但由于副产物必须通过引入乙酸乳酸合成酶、丙氨酸外消旋酶和d -氨基酸氧化酶来去除，因此反应过程比较复杂。(TayLor等人，1998年； Zhu 等人，2011年； Fotheringham 等人，1999年)。以苯胺或异丙胺为氨基供体，用x-转氨酶合成了L-ABA，是一个热动力学不对称反应。（Park等人，2010年；Seo等人，2012年；Park等人，2013年)。这是一条很有前途的L-ABA生物合成路线。另一种生物合成方法是利用亮氨酸脱氢酶将a-酮丁酸加氢得到88%的收率(GaLkin et aL. 1997)。然而，a-酮丁酸难以获得。我们开发了一种新的生物合成工艺，通过L-苏氨酸脱氨酶(ILva)催化本体化学物质L-苏氨酸脱氨，然后通过L-亮氨酸脱氢酶(LeuDH)进行氢化反应。 (Tao et aL. 2013)采用甲酸盐脱氢酶(FDH)催化NADH再生(图1)该syn- thesis工艺在50 L范围内产率为6.37 ，收率为97.3%。

为了降低生产成本，我们开发了一种基于超酶技术的L-ABA生产工艺，对合成工艺进行了优化。

图1 L-2-氨基丁酸是由L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶催化L-苏氨酸生物合成的，甲酸作为甲酸脱氢酶催化NADH再生的共底物(Tao et aL. 2013)

材料与方法

材料

在前期的研究中构建了含有pET28b- ILvA (BL21- ILvA)、pET28b Leudh (BL21- LDH)和pET24a-fdh (BL21-FDH)的重组大肠杆菌BL21 (DE3)菌株，分别表达ILvA、Leudh和FDH (Tao et aL. 2013).

在7L发酵罐中分批发酵或分批加料发酵

将重组菌株BL21- ILvA、BL21- LDH和BL21- FD,H在60 mLBP培养基中以37 ℃ (220 rpm)的温度培养过夜，加入卡那霉在素50 g ，作为种子培养。

将BL21- ILvA和BL21-LDH的种子培养物分别接种于4 L的初始培养基(酵母提取物24 g ,色氨酸12 g,甘油5 g)和7 L的发酵罐中,培养在37℃、 400 rpm搅拌和5L曝气条件下。采用和NaOH控制pH为6.8—7.2，将发酵温度控制在28 ℃左右，直至发酵结束。

酶纯化

取细胞在7000g 的转速下离心10 min,用1000 mL无菌水冲洗2次,再悬浮于0.1 M磷酸盐缓冲液中(pH 7.5)。在10摄氏度环境中培养30分钟后，用2500 rpm的磨砂机(MiniZeta)将重新悬浮的细胞裂解30分钟。将裂解液在10,000g的转速和4℃条件下离心20分钟，粗酶在上清液中

粗酶通过50％饱和浓缩。收集沉淀的蛋白质,然后通过亲和柱色谱进行最终纯化。用50mm磷酸盐缓冲液(pH 7.5, 350 mM咪唑)洗脱蛋白，对合成的活性组分进行了超滤浓缩脱盐，并进行进一步的实验研究。

酶固定

将预处理后的环氧树脂或氨基树脂(Resindion SRL)加入含有纯化的ILvA、FDH、LeuDH或其混合物的酶溶液(1m磷酸盐缓冲液 , pH =7.8)中。上述混合物在25°C和250转/分的条件下培育下6~10h。过滤后用0.2 M磷酸盐缓冲液洗涤三次(pH =7.8)，固定酶被浸泡在含有50 % (v/v) 的甘油和50 % (v/v) 2-巯基乙醇中，并储存在4℃的环境中。

酶转化

转化实验是在30℃，含有200mL反应溶液（9%L-苏氨酸、4.8%氨甲酸胺、4.5%、固定的ILvA、LeuDH和FDH）的0.5L烧杯中进行的。使用15％(v/v)OH控制PH值在7.5左右，并通过IKA搅拌器搅拌使反应物混合。培育2h后，L-ABA浓度停止增加，取上清液用高效液相色谱法测定L-苏氨酸和L-ABA的含量。

活性测定

根据前人的研究，对ILvA、LeuDH和FDH的活性进行了抑制 (Umbarger and Brown 1957; Ansorge and KuLa 2000; Berrios- Rivera et aL. 2002).

氨基酸的高效液相色谱分析

采用LC-18DB柱(5mL, 4.6 9 9 9 250 mm, AgiLent)高效液相色谱法测定L -苏氨酸和L-ABA的浓度

结果

L-苏氨酸脱氨酶(ILvA)、L-亮氨酸脱氢酶(LeuDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的生产和纯化。

分批发酵18 h, ILvA和LeuDH的活性分别达到371和163 U mL^-1 ，足以进行后续的转化实验(图2)。由于FDH的比活性较低，因此采用分批发酵以提高其活性。培养22 h后，其活性达到14 U mL^-1 (图3a)。SDS-PAGE表明，它目前已在一个较高的表达水平(图3b)

用Ni² 进行18倍、20倍和19倍的亲和柱层析法纯化后、ILVA、LeuDH和FDH的收率分别为79%、83%和91%。纯化ILVA、FDHAN的具体活性分别为122 U mg^-1、7 U mg^-1和27 U mg^-1.

L -苏氨酸脱氨酶(ILvA)、L -亮氨酸脱氢酶(LeuDH)和甲酸脱氢酶(FDH)的固定化

环氧树脂比氨基树脂更适合于ILvA、LeuDH和FDH的固定化

图2重组大肠杆菌BL21 (DE3)菌株分批发酵的ILvA (a)和LeuDH（b）产物活性与时间的关系。测定湿细胞重量和活性，一式三份，p值\0.05。ILvA和LeuDH分别是L-苏氨酸脱氨酶和L-亮氨酸脱氢酶

图3菌株BL21 (DE3)在分批发酵中产生FDH(甲酸脱氢酶)的活性与时间的关系（a）和SDS-PAGE分析(b)测定湿细胞重量和活性，一式三份，p值\ 0.05。1、2、3号泳道分别为培养14h、18h和22 h后重组大肠杆菌BL21 (DE3)的可溶性部分;Lane M为分子质量标准蛋白;箭头表示FDH的频带。

(补充表1)每g环氧树脂添加50 - 100mg的ILvA、LeuDH或FDH可获得最佳的固定化收率和活性。采用环氧树脂，每g树脂中加入50 - 100mg的酶，进行共固定化实验。与其他两种酶共固定化时，ILvA的活性变化不大(补充表2)，而与LeuDH、FDH或两者同时固定化时，ILvA的活性明显下降。说明LeuDH和FDH与环氧树脂的结合比ILvA更容易

固定化酶体系生产L-ABA的研究

ILvA、LeuDH和FDH共固定化使L -苏氨酸转化率最低(表1)，当ILvA与FDH共固定化或FDH和LeuDH同时固定化时，L -苏氨酸的转化率和L-ABA的相对产量均显著降低。单独固定化ILvA和与LeuDH共固定化FDH时，L -苏氨酸的转化率和L-ABA的收率最高，分别为99.9%和90%。L-ABA的产量达到70 g以上，明显高于单独采用immo- biLizase - ase体系和其他共固定化酶系统。通过三批转化试验，获得了99%以上的L -苏氨酸转化率和95%以上的理论L-ABA收率(图4)

图4可回收一罐制得的L -2-氨基丁酸(L-ABA)。转化率100%为90.0 g L-苏氨酸的完全转化率;以L-ABA 的理论收率77.9 g为100%相对收率;所有检测均为一式三份，p值0.05。

表1固定化酶体系生产L-ABA情况