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节杆菌启动子活性片段的克隆与分析开题报告

 2020-04-14 04:04  

1. 研究目的与意义(文献综述包含参考文献)

文 献 综 述

节杆菌(arthrobacter)在19世纪初首次从土壤中分离得到[l],并且是土壤中最常分离到的土著性好氧微生物[2一5]。由于这一类细菌在形态学类似于来源于动物的棒杆菌,最初将其归属于棒杆菌属(corynebacterium) [6]。但是现代系统分析表明节杆菌的成员在分类上应隶属于放线菌微球菌科(micrococcaceae) [6].节杆菌属、短杆菌属(brevibacterium)、棒杆菌属同属于棒状杆菌群 (coryneform group)。节杆菌最典型的特征就是细胞在生长循环过程中产生显著的形态变化。早期培养物的细胞呈革兰氏阴性的不规则细杆状,部分杆菌按一定角度排列,而在停止期培养物中,细胞则呈革兰氏阳性的球形,当转接到新鲜培养基中,这些球状细胞又会产生分支,形成新的不规则杆状,如此循环往复。有关这种独特的生长循环模式的分子机理仍然有待研究。根据bergey手册,该属的其他特征有:革兰氏阳性,不抗酸,不产抱子,接触酶呈阳性,严格好氧,化能异养型,细胞壁肚聚糖以赖氨酸作为双胺酸,含有枝状细胞脂肪酸,具有高g c含量(dna的g c克分子含量在60%至72%之间),最适生长温度在20℃到30℃之间。截至撰写此论文时,节杆菌属现在主要包括74个种,例如球形节杆菌(arthrobacterglobiformis)、简单节杆菌(a.simplex)、金黄色节杆菌(a.aurescens)、嗜尼古丁节杆菌(a.nicotinovorans)、成晶节杆菌(a.crystallopoietes)等。其中球形节杆菌是模式种。节杆菌广泛存在于自然环境中,其成员是土壤中的优势菌群,有时是好氧菌总数中最多的单组细菌[6]。节杆菌既存在于普通土壤中,又可以生存于极端环境中,例如南极海冰、金属污染的地区、化学污染地区以及放射性环境[7一12]。近年来有报道节杆菌有条件致病性或可从人体标本中分离得到[13]。

启动子是基因表达调控的重要顺式元件, 也是基因工程表达载体的一个重要组成部分。启动子的克隆对于构建基因工程载体, 表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多,从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到pcr方法的应用, 此后相继问世的一些基于pcr法的克隆启动子技术, 像i-pcr、p-pcr、ssp-pcr、yade、tail-pcr等, 为克隆启动子提供了更可靠, 更合理的方法。

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2. 研究的基本内容、问题解决措施及方案

2.本课题要研究或解决的问题和拟采用的研究手段(途径):

2.1 研究解决的问题

启动子可以被RNA聚合酶辨认,并开始转录。在RNA合成中,启动子可以和决定转录的开始的转录因子产成相互作用,控制基因表达的起始时间和表达的程度,包含核心启动子区域和调控区域,就像”开关”,决定基因的活动,继而控制细胞开始生产哪一种蛋白质。本研究希望能通过节杆菌中启动子探针质粒,找到具有不同强度启动子能力的启动子,并能在合成中得到应用。

序列2.2 采用的研究手段

(1)利用启动子探针载体筛选启动子

(2)利用PCR技术克隆启动子

①环状PCR

②利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子

③YADE法

④TAIL-PCR

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