阿扎霉素聚酮合酶烯基还原酶结构域开关机制初探开题报告

 2020-02-10 10:02
1.目的及意义(含国内外的研究现状分析)

1.1研究背景及其意义

聚酮化合物在次级代谢产物中是最大的一类,包括大环内酯、四环类、蒽醌类和聚醚类在内的许多化合物均属于这个大家庭。聚酮化合物是通过聚酮合酶(Polyketide synthase, PKS)催化形成的,其催化过程类似于脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)催化的脂肪酸生物合成。到目前为止,已经揭示的聚酮合酶可以分为三类:I型、II型和III型。

I型PKS由几个多功能模块(Module)组成,每个模块负责聚酮碳链合成中的一轮碳链延伸。每轮延伸可以在主链上延长两个碳单位。每个模块由若干催化酶组成,这些参与合成途径的酶包括:酰基转移酶 (Acyl transferase, AT)、酮脂酰-ACP合成酶(Ketoacyl-ACPsynthase, KS)、脱水酶(Dehydratase, DH)、烯醇还原酶(Enoylreductase, ER)、硫酯酶(Thioesterase, TE)。通过这些酶的依次作用,将羧酸起始单元或者延伸单元加载到各个酰基载体蛋白(Acyl carrier protein, ACP)上并进行一系列生化反应获得聚酮产物,再通过某些后修饰途径获得目标代谢产物。尽管各种聚酮化合物结构各异,但复合聚酮化合物结构的多样性来自于聚酮骨架组成单位的多样性、每个碳单位的不同还原程度和延伸的碳链长度,并且这些化合物结构的变化与相应催化蛋白结构域的变化具有线性关系,这是聚酮化合物最大的特点之一,这说明我们可通过模块内或模块间的合理重组或删增设计出新的生物合成途径,从而得到我们想要的高活性、高产量和低毒副作用的目的抗生素。这也是I型PKS作为组合生物学主要研究对象的重要原因之一。

II型PKS是一个多功能酶复合体,只包含一套可重复使用的结构域,每一结构域在重复的反应步骤中都多次地用来催化相同的反应,这是其与Ⅰ型PKS主要的不同所在。

不同于I型和II型PKS常常通过ACP活化酰基-CoA的底物,III型PKS直接作用于酰基-CoA活化的简单羧酸。尽管结构和机制不相同,但所有类型的PKS都是通过酰基-CoA的脱羧缩合和KS结构域或亚基催化C-C键的形成。在进化关系上III型PKS与其它PKS及已知的FAS也相距甚远。

在对阿扎霉素F的生物合成基因簇进行分析时发现,阿扎霉素F实际的碳骨架与负责其合成的PKS 基因簇之间存在着结构与基因非线性对应关系,其不对称现象具体体现在:阿扎霉素F的碳骨架是由20轮碳链延伸而成,但负责其碳链延伸的PKS基因却只存在着19个模块。研究人员通过仔细比对结构与基因之间的关系发现,其不对称现象主要存在于前三轮的碳链延伸:(1)负责阿扎霉素F碳链延伸的PKS基因中缺少一个负责首轮碳链延伸的模块。(2)AzlB蛋白中负责催化第三轮碳链延伸的模块3由于缺少ER结构域,因此应该产生一轮不饱和延伸,而阿扎霉素F的第三轮碳链延伸实际上是一轮饱和延伸。根据阿扎霉素F的异源表达的相关文献报道表明:阿扎霉素F的碳骨架延伸所需的所有基因均存在与阿扎霉素F的生物合成基因簇中,表明负责阿扎霉素F首轮碳链延伸的模块也存在于该合成基因簇中,同时也表说明负责第三轮双键还原的ER 结构域同样存在于阿扎霉素F的生物合成基因簇中。

1.2研究现状

1959年,意大利的Arcamone D等从生孢链霉菌(Streptomyces melanosporus)中首次分离得到阿扎霉素B,命名为Elaiophylin。随后在其它种的链霉菌中也相继发现,分别定名为Azalomycin B,Antibiotic 225E。但由于其结构新颖,化学稳定性差,直到1981年,通过波谱分析,物化分析,化学降解,才推导出化学结构式,并得到X-晶体衍射分析的有力支持,它具有典型大环内酯抗生素的抗菌的典型特征,对枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、白喉棒状杆菌、破伤风芽孢杆菌有抑制作用。

阿扎霉素F为吸水链霉菌阿扎霉素变种(Streptomyces hygroscopicus var. azalomyceticus)所产的36元大环内酯化合物,主要组分为阿扎霉素F3a、F4a和F5a。据报道,S. hygroscopicus、S. malaysiensis等链霉菌均可代谢产阿扎霉素F结构类似物。阿扎霉素F系列化合物自发现以来,其研究主要集中在活性测试和结构鉴定等方面,但对该抗生素的生物合成机制尚未有研究报道。特别是抗肿瘤活性的发现,预示着该系列化合物在临床药物方面的潜在开发价值,更加激发了人们对其生物合成机制研究的浓厚兴趣。本研究使用的菌种编号为Streptomyces sp. 211726,由洪葵教授在海南省的沿海红树林根系土壤中分离纯化得到。它可以产生13种阿扎霉素F系列化合物,其最主要的区别在于胍基和第23、25位碳原子上修饰基团的不同。其中S13,S15和S16分别与F3a F4a和F5a在结构组成上相同,是同一种化合物。

2.研究(设计)的基本内容、目标、拟采用的技术方案及措施

2.1研究(设计)的基本内容

定点突变技术失活阿扎霉素聚酮合酶中可能影响烯基还原酶开关的功能结构域。

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