罗勒叶中内生真菌提取物的抑菌及抗氧化成分的研究

Piyamas Atiphasaworn¹ bull; Sakon Monggoot¹ bull; Eleni Gentekaki¹ bull; Siraprapa Brooks¹ bull;Patcharee Pripdeevech¹

摘要：从泰国北部采集的罗勒植物叶中已经提取出14种内生真菌，共鉴定出8个菌属：曲霉属（Aspergillus）、棉壳二孢菌属（Ascochyta）、黑孢菌属（Nigrospora）、芽生菌属（Blastomyces）、刺盘孢菌属（Colletotrichum）、黑胶菌属（Exidia）、斜盖伞属（Clitopilus）、野村菌属（Nomuraea）。对所有内生真菌粗提物抵抗人体9种细菌病原体的抗菌活性进行了测试，其中包括金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、革兰阴性葡萄球菌（Staphylococcus epi- dermidis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）和副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）。所有粗提物均有一定的抑菌活性，但黑孢菌MFLUCC16-0605具有广谱活性，其MIC值在7.81-250g/ml之间。用DPPH自由基清除法研究了粗提物的抗氧化活性，其中MFLUCC16-0605粗提物具有较高的抗氧化活性（IC50值15.36lg/mL），可与金雀花酸和没食子酸的标准相比，它们的IC50值分别为2.56和12.89Lg/mL。用GC–MS法测定了MFLUCC16-0605粗提物的化学成分，共鉴定出62种化合物，占粗提物的92.09%，其中六种主要成分包括5E（5E）、9E-法尼基丙酮（9E- farnesyl acetone）、柱花素（columellarin）、甲苯油萜（totarene）、月桂烯-2-酮（laurenan-2-one）、8S，13香草醛（8S，13-cedranediol）。PCR扩增及条形码区的序列测定证实MFLUCC16-0605为黑孢菌属。MFLUCC16-0605的显著活性表明，内生菌是一种潜在的自然资源，其作为抗菌/抗氧化剂的用途有待进一步探索。

简介

微生物内生真菌是存在于植物组织中而不引起疾病的内共生菌^{[1, 2]}。内生菌分布于世界各地，并在迄今为止所检测过的所有植物中发现。虽然自然界有42万种植物与之交配，但对其内生成分的研究相对较少^[3]。据估计，内生真菌占全球真菌多样性的7%^[4]。内生菌与植物的共生关系是互利共赢的；寄主植物为内生菌提供必需的营养。反过来，内生真菌通过防止植物病原体入侵和提高寄主植物对主要生物或非生物因子的抗性和耐受性^[7]来辅助宿主植物和/或寄生虫^{[5, 6]} 。尽管如此，环境条件可能会影响内生菌和寄主植物之间的共生平衡^[8]。内生菌产生与寄主植物类似的生物活性化合物，包括生物碱、肽、甾醇、萜类、酚类、奎宁类和黄酮类^[9]。此外，还报道了内生真菌次生代谢产物的新化学骨架^{[10, 11]}。由于内生菌具有广泛的代谢产物及其能抑制植物、动物和人体内的几种病原体，因而被认为是一种很有前途的抑菌^[12]，抗真菌^[13]，与抗氧剂^[14]的资源。此外，内生菌因其生产生物燃料、myco-柴油烃和烃衍生物的能力而闻名^[15]。因此，目前的研究主要集中在内生菌的多样性、化学组成和生物活性上，以寻找新的抗生素和生物燃料。尽管有这些显著的好处，但只完成了相对较少的内生菌研究。

罗勒属植物属于唇形科（Lamiaceae），其中包含150余种。这个科的植物包括罗勒（O. basilicum）、罗勒变种（O. basilicum var. thyrsiflora）、圣罗勒（Ocimum sanctum）、南美罗勒（Ocimum canum）、丁香罗勒（Ocimum gratissimum）、小罗勒（Ocimum minimum）^{[16, 17]}，在世界各地都有广泛栽培。在150种植物中，O. basilicum，也被称为罗勒，是最受欢迎的草药之一，具有广泛的用途。罗勒的叶和花以其驱风、催乳和解痉的特性而闻名，因此被用于治疗头痛、咳嗽、腹泻、蠕虫和肾脏感染^{[18, 19]}。由于它们的芳香性，罗勒精油在烹饪和香料工业中得到了广泛的应用。罗勒含有挥发性的酚类化合物，具有不同程度的抑菌和抗氧化活性，这两种活性在不同种属和品种之间都有差异。罗勒（Ocimum basilicum var. thyrsiflora），又名泰国罗勒，原产于东南亚，在泰国广泛种植^[20]。这种植物的治疗潜力已被文献详细记载，包括消炎，抗氧化，皮肤治疗，整体健康，和用于治疗溃疡性结肠炎的药物^{[21, 22]}。

在这项研究中，使用了泰国罗勒叶对目前存在的内生真菌进行初步鉴定。此外，还对所鉴定的内生菌的抗氧化和抑菌活性进行了评估。最后，我们利用气相色谱–质谱（GC–MS）鉴定了特定内生真菌中的挥发性成分。

材料与方法

植物材料

2016年2月，在泰国北部清莱省（99°55⁰14⁰⁰E, 19°59⁰38⁰⁰N）的开花期采集到了泰国罗勒叶。泰国罗勒的一种植物标本（QBG No. 41462）被指定存放在泰王国清迈诗丽吉皇后植物园（Queen Sirikit Botanic Garden, Mae Rim）。

内生真菌的分离，培养及形态特征

泰国罗勒的健康叶片用自来水冲洗1分钟，用70%乙醇浸泡30s进行消毒灭菌，接着用1%次氯酸钠浸泡1min，其后用无菌软化水进行清洗。然后将叶子切成50片0.5cm²大小的片状，接着放置在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）无菌培养基中，其中含有氯霉素（100 lg/mL）以抑制细菌生长。将培养皿在室温（28°C）下培养3天。随后将所有形成菌落的内生真菌分离出来并置于新的PDA平板上。所有培养皿用封口膜包裹，置于室温保存1周。将所有纯分离物在马铃薯葡萄糖肉汤(PDB，0.4%w/v马铃薯提取物，2.0%w/v葡萄糖)中在室温下进一步培养1个月。通过将PDA中分离的每种培养物的5个菌丝体琼脂塞（直径6mm）加入150毫升 PDB培养基中，在500毫升 Erlenmeyer烧瓶中制备预接种物。根据改良的弗里斯瓦德法（Frisvad）和参孙法（Samson）^[23]对内生真菌进行鉴定，包括对菌丝体、无性/有性孢子和菌落形态的显微观察。

乙酸乙酯萃取粗提物

根据Tomsheck方法获得了所有内生真菌的粗提物^[15]。所有培养物用150毫升乙酸乙酯在室温下浸泡3天，然后用500毫升的分液漏斗进行分离。用等体积（3 9 100 mL）的乙酸乙酯萃取剩余的PDB培养液。将从菌丝体和PDB培养液中提取的乙酸乙酯提取物合并后用真空旋转蒸发器（(Buchi rotavapor型号R 114，Buchi）在40℃下减压浓缩。随后将浓缩的粗提物在-20℃条件下进行保藏。

抑菌活性的测定

在该研究中使用了9中人类致病菌：：革兰阳性金黄色葡萄球菌ATCC 25923（the Gram-positive Staphylococcus aureus ATCC 25923）；表皮葡萄球菌ATCC 12228（S. epidermidis ATCC 12228）、枯草芽孢杆菌TISTR 008（Bacillus subtilis TISTR 008）、蜡样芽胞杆菌ATCC 11778（B. cereus ATCC 11778）、革兰氏阴性大肠杆菌ATCC 25922（the Gram-negative Escherichia coli ATCC 25922）、肺炎克雷伯菌ATCC 700603（Klebsiella pneumoniae ATCC 700603）、铜绿假单胞菌ATCC 27853（Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853）、霍乱弧菌DMST2873（Vibrio cholerae DMST 2873）、副溶血性弧菌DMST 21243（V. parahaemolyticus DMST 21243）。带有ATCC和TISTR编码的细菌来自泰国巴瑟姆萨尼（Pathum Thani）科学技术研究所的医学科学系，而带有DMST编码的细菌则来自曼谷卫生部的典型培养物保藏的医学科学系。最初，将细菌菌种接种在无菌的苗勒欣顿（Muller Hinton）琼脂平板上，并置于37℃下培养24h。接着在测定前将细菌菌株在胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB培养基）中传代培养24h。根据Mar 和 Pripdeevech^[24]描述的纸片扩散法对粗提物的抑菌活性进行评估。采用二重连续稀释法，用乙酸乙酯作溶剂对浓缩的粗提物进行稀释。将每种粗提物稀释至3.91, 7.81, 15.62, 31.25, 62.25, 125, 250, 500,1000 lg/ml。对于每种浓度，将浸有30 L粗提物的6mm无菌圆纸片（Whatman^TM, USA）置于含有细菌的琼脂平板上，做三个平行组，以浸有乙酸乙酯溶剂的圆纸片作为阴性对照。此外，以溶解在蒸馏水中的氯霉素作为参考对照。所有平板在37℃下培养24h。为确定抑菌活性，测量包括可直视的清晰区域的最小抑制浓度（MIC）的圆纸片直径。

抗氧化活性测定

用2,2-二苯基-2-苦肼基（DPPH）法测定粗提物的抗氧化活性。根据Pripdeevech和Machan^[25]测定甲醇提取物对DPPH自由基的影响。将1毫升不同浓度（3.91、7.81、15.62、31.25、62.25、125、250、500和1000 lg/mL）的甲醇中的每种提取物加入1mL 60mM的DPPH甲醇溶液中。震荡混合物后静置30分钟。用紫外分光光度计（Perkin–Elmer– Lamda 25 UV/vis）在517nm处测定每种混合物的吸光值。用下列公式计算了自由基DPPH抑制率I% = 100 9 (AControl-ASample)/ AControl，其中AControl是控制反应的吸光值（含甲醇试剂，不含任何粗提物），ASample是粗提物的吸光值。所有内生真菌提取物的抗氧化活性均用 IC₅₀值(LG/mL)表示，以水溶性维生素E和没食子酸为对照。

黑孢菌MFLUCC16-0605挥发性组分的GC–MS分析

在本研究中鉴定的内生真菌中，黑孢霉MFLUCC16-0605具有较强的抑菌和抗氧化活性。因此，选择该分离物来进一步测定其粗提物的化学组成。用GC–MS仪器（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）对黑孢菌MFLUCC16-0605挥发物进行提取分析，它配备有HP型号5973质量选择探测器和电子碰撞（EI）离子源。用HP-5MS毛细管柱(30m 9 0.25 mm内径，膜厚0.25mu;m；拉蒙美国安捷伦科技公司)分离样品。炉温程序为最初设定在60°C，并以3°C/min的速率逐渐增加到200°C，采用高纯氦（99.99%）作为载气，以1mL/min的恒定流速设定。在注入口传输线和离子源温度均设定在250°C，采用70V的EI电压，全扫描时质量扫描范围设定为29～300amu，采用分流模式进行注射，分流比为100:1，溶剂延迟时间设定为5分钟。采用MSD ChemStation数据分析对数据进行处理，通过比较Kovaacute;ts保留指数，相对于C₉–C₂₃正构烷烃的保留指数，并将得到的样品的质谱与Wiley和NIST数据库中标准品的质谱进行比较，确定了黑孢菌MFLUCC16-0605的所有挥发性组分。所确定的成分及其相对峰面积百分比汇总于表2。

MFLUC16-0605的形态及分子鉴定

根据ITS4-5.8-ITS5区的形态学观察和序列测定来分类鉴定。为了研究MFLUCC16-0605菌株的宏观及微观形态特征，需将其接种在PDA平板上，并置于室温（28°C）的黑暗条件下生长2周，每天观察其菌落状态及生长速度。根据Vega^[26]及Visagie^[27]等人的判断完成了形态学鉴定，根据Peterson^[

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