论文总字数：22255字

摘 要

来源于E. coli BL21(pET-22b-palⅠ) 重组工程菌的蔗糖异构酶（SIase）可催化蔗糖异构化反应异麦芽酮糖。由于野生菌的表达量低，培养条件复杂，酶的最适反应温度较低等缺陷，给蔗糖异构酶的催化反应与异麦芽酮糖的工业化生产带来了很多困难。

本论文简要论述了蔗糖异构酶的发酵纯化过程，高效液相色谱法和 3,5-二硝基水杨酸法两种酶活测定方法，重点论述了以及蔗糖异构酶固定化的方法、载体及固定化酶的酶学性质的研究。具体研究内容和结果如下：

①E. coli BL21(pET-22b-palⅠ)重组菌株在发酵，破碎离心后提取的粗酶液，经过Ni-NTA柱纯化，在100 mM咪唑的洗脱液中可检验到较高酶活，其蛋白分子量在65 kDa左右。

②固定化体系选择SI-M-TiO₂，固载蔗糖异构酶的条件为：起始给酶量0.149 U/ml，载体（抽滤）质量与酶液的体积比为1:40（g:ml），酶液缓冲液是50 mmol/L、pH6.0的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾；载体与酶液在15℃、120rpm摇床中固定化6h。此条件SI-M-TiO₂表观酶活回收率达到为84.75%，表观酶活5.04 U/g。种酶催化蔗糖反应的最适缓冲体系均为100 mmol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲，最适pH均为6.0最适温度都在30℃。

关键词：蔗糖异构酶 固定化酶 固定化条件TiO₂

Research of immobilization of sucrose isomerase

Abstract

The sucrose isomerase from E. coli BL21(pET-22b-palⅠ) could catalyze the isomerization of sucrose to isomerides: isomaltulose.Because of the low expression level, complex cultural conditions and low reaction temperature of the wile type bacteria, there are lots of problems in the SIase catalysis reaction and the isomaltulose commercial process.

This paper briefly discusses sucrose isomerase in fermentation, purification process, High performance liquid chromatography and 3,5-Dinitrosalicylic acid method for the determination of activity units of phytase. Focuses on the research of the method of sucrose isomerase immobilized carrier and enzymatic properties of the immobilized enzyme. The contents and results are as follows:

①The crude enzyme solution was broken, centrifuged and centrifuged from recombinant strains, after Ni-NTA column purification in 100 mM imidazole eluate to a higher activity can be tested.its molecular weight of about 65 kDa protein.

②Immobilized system selects SI-M-TiO2. sucrose isomerase immobilization conditions are: initial amount of enzyme to 0.149 U / ml, the carrier (suction) mass ratio of the volume of enzyme solution 1:40 (g: ml ), enzyme buffer was 50 mmol / L, pH6.0 potassium dihydrogen phosphate - dipotassium hydrogen phosphate; enzyme carrier liquid 15 ℃, 120rpm shaking immobilized 6h. This condition SI-M-TiO2 apparent recovery rate was 84.75% activity, the apparent activity of 5.04 U/g. The optimal buffer system for enzyme to catalyzed sucrose are 100 mmol / L citric acid - sodium citrate buffer, pH optimum 6.0 are optimal temperature in 30 ℃.

Key Words: Sucrose isomerase; Immobilized enzyme; immobilization conditions; TiO₂

目 录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1酶的固定化 1

1.2酶的固定化方法 1

1.2.1吸附法 1

1.2.2共价结合法 2

1.2.3交联法 2

1.2.4包埋法^[11] 3

1.3酶固定化的载体 3

1.4固定化酶的评价指标 3

1.4.1酶的活性 3

1.4.2酶蛋白固定化率 4

1.4.3固定化酶的酶活回收率 4

1.4.4相对酶活 4

1.4.5残余酶活 4

1.4.6酶的半衰期 4

1.5固定化酶的性质 4

1.5.1固定化对酶的影响 4

1.5.2固定化酶的稳定性 4

1.5.3固定化酶的催化特征 5

1.6 TiO₂ 5

第二章 蔗糖异构酶的纯化 6

2.1材料与方法 6

2.1.1 实验菌种 6

2.1.2 实验试剂与仪器 6

2.1.3 培养基及培养条件 7

2.1.4 SIase纯酶的获得及酶活测定的方法 7

2.2 结果与讨论 9

2.2.1 蔗糖异构酶SIase的纯化 9

2.2.2蛋白标准曲线 10

2.2.3异麦芽酮糖标准曲线 10

第三章 酶的固定化、固定化酶的酶学性质和批次反应 12

3.1 材料与方法 12

3.1.1 材料 12

3.1.2方法 12

3.2.实验结果与讨论 14

3.2.1固定化载体对酶活的影响 14

3.3 米氏常数K_m和最大反应速率V_max 18

3.4 小结 19

3.5 酶学性质研究 20

3.5.1 最适反应缓冲体系 20

3.5.2 反应最适缓冲体系浓度 20

3.5.3 反应最适pH 21

3.5.4 反应最适温度 22

3.5.5 pH稳定性 23

3.5.6 温度稳定性 23

3.6 小结 24

3.7 反应进程曲线 24

3.8批次反应与半衰期 25

第四章 结果与讨论 27

4.1 结论 27

4.2 展望 27

参考文献 29

致 谢 31

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