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摘 要

为了能满足枯草芽孢杆菌的大规模生产，本文探索了培养原料十倍浓缩煮沸灭菌，再加入未灭菌的自来水或地下水作为枯草芽孢杆菌培养基这一开放式发酵。实验结果表现：在-4℃条件下放置2h时，活菌转化为芽孢最多，转化率为100%。培养基不经过高温高压灭菌情况下，可以使枯草芽孢杆菌摇瓶发酵连续培养3代。培养基十倍浓缩灭菌开放式发酵煮沸时间为25min，接种量为10%，

摇瓶发酵可以使枯草芽孢杆菌连续转接7代。培养基十倍浓缩间歇煮沸灭菌在开放式摇瓶发酵中可以使枯草芽孢杆菌连续转接至13代。

关键词：枯草芽孢杆菌；芽孢率；开放式发酵；十倍浓缩煮沸灭菌

Open fermentation of Bacillus subtilis

ABSTRACT

In order to meet the requirement of mass production of Bacillus subtilis. In this paper, we explore the training materials ten times concentrated boiling sterilization, add not sterilized tap water or groundwater as Bacillus subtilis culture based open fermentation. The experimental results showed that when the 2H was placed at -4, the living bacteria transformed into the most spore, and the conversion rate was 100%. The culture medium can make the 3 generation of Bacillus subtilis shake flask fermentation in the case of high temperature and high pressure sterilization. The fermentation time was 25min, the inoculation amount was 10%, the fermentation time was ten, and the shaking flask fermentation could make the Bacillus subtilis continuous transfer to the 7 generation. The culture medium is ten times of the concentration of the intermittent boiling sterilization opening shake flask fermentation can make the continuous transfer of Bacillus subtilis 13 generations.

Key words: Bacillus subtilis; spore rate; open fermentation; ten fold concentration and boiling sterilization

目 录

摘 要 I

ABSTRACT II

第一章 文献综述 1

1.1研究现状 1

1.2微生物的开放式发酵 1

1.2.2开放式发酵的应用 2

1.3枯草芽孢杆菌高密度培养 2

1.3.1微生物的高密度培养 2

1.3.2影响高密度培养的因素 3

1.4研究的目的及意义 4

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1菌株 5

2.1.2 主要试剂和仪器 5

2.1.3 培养基 5

2.1.4 培养方法 6

2.1.5 分析方法 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 活菌转变为芽孢的条件优化 8

2..2.2完全开放式发酵 8

2.2.3 培养基十倍浓缩灭菌煮沸时间的选择 9

2.2.4不同接种量对培养基十倍浓缩煮沸灭菌开放式发酵的影响 9

2.2.5 间歇灭菌对培养基十倍浓缩煮沸灭菌开放式发酵的影响 9

第三章 结果与讨论 10

3.1 活菌转变为芽孢的条件优化 10

3.2 完全开放式发酵 10

3.3 培养基十倍浓缩灭菌煮沸时间的选择 11

3.4 不同接种量对培养基十倍浓缩煮沸灭菌开放式发酵的影响 11

3.5 间歇灭菌对培养基十倍浓缩煮沸灭菌开放式发酵的影响 12

第四章 结论与展望 14

4.1 结论 14

4.2 展望 14

参考文献 15

致 谢 16

第一章 文献综述

1.1研究现状

微生物采油是一种成本低，操作简单的采油技术。微生物用于三次采油。在文献中许多机制提出了通过微生物促进残余油动员的方法^[1]。在此，我们专注于降低界面张力的微生物采油机制和亲水微模型，使用导致芽孢杆菌生产生物表面活性剂的原理^[2]。

从微生物采油技术所用到的微生物来看，激活油层本源微生物和注入引入外源微生物，本源微生物竞争中不占据优势地位，在这些外源微生物中，枯草芽孢杆菌具有多方面的优势，本文通过提高枯草芽孢杆菌的活性和数量进行优化。

本文我们采用了高密度培养的方法来作为提高微生物产量的途径，他可以缩小生物反应工具的体积，降低设备投资基金，缩短其发酵周期，提高最终菌体的生物量和最终产物的时空产率，降低水电的使用，减少生物成本和便于下游的分离纯化工艺等。

1.2微生物的开放式发酵
1.2.1枯草芽孢杆菌开放式发酵方法

根据菌株的特性，将枯草芽孢杆菌菌种与培养基成分混合制成枯草芽孢杆菌培养制剂，采用无需灭菌、接种和密闭培养条件的开放式液体培养方法进行小规模枯草芽孢杆菌的发酵培养 ^[3] 。开放式发酵，其操作过程是开放的，原料和设备不灭菌或部分灭菌，只需要洗刷干净即可，所以发酵会带入大量的杂菌，目前国内的开放式发酵主要集中在混合菌群的固体发酵，对单一菌种的开放式发酵研究较少。

1.2.2开放式发酵的应用

Bo Zhao等^[4]在利用芽孢杆菌生产L-乳酸的研究中采用开放式发酵的方法，即底物葡萄糖、酵母膏等营养物质未灭菌，将发酵液离心后的菌体作为下一代培养的种子的方式没课讲芽孢杆菌连续转接培养9代，结果表明，L-乳酸的生产量得到了显著的提高，并且L -乳酸光学纯度的检测结果超过了99%。

通过对发酵过程中可溶性糖、乳酸、总糖和细菌数量的变化的研究，对开放式发酵的原理进行分析。不灭菌底物的开放式发酵是一种简单而有效的利用食品废弃物来生产乳酸的方法。其结果表明，食物废弃物适宜作为乳酸发酵的底物，在不添加任何营养物质的情况下，它可以促进微生物的增殖。利用开放式发酵，从食品废物中产生的36.29克/升^[5]的乳酸，远远高于封闭发酵（底物灭菌）。废弃物中的土著菌群可以分解复杂多糖，并为乳酸菌提供可发酵性的底物，从而来提高乳酸的产量。

1.3枯草芽孢杆菌高密度培养

本次毕业设计我们以实验室保存的枯草芽孢杆菌FC96^[6]为本次实验的材料。首先我们通过对该菌株所采用的摇瓶发酵工艺的技术和结果数据进行摸索，对其有更多的认识，找到最适合该菌株发酵的最佳培养基的成分和最佳的发酵条件，从而采取进一步优化。在干燥过程中保证该菌的最大的存活率。采用单因素筛选试验的方法对FC96的液体发酵培养基的优化进行了研究。确定了适合FC96液体发酵培养基的碳源为葡萄糖，无机盐为磷酸二氢钾，最佳氮源为牛肉膏。实验中牛肉膏、葡萄糖和磷酸二氢钾的最佳配比，我们采用了响应平面设计的方法来对其进行优化^[7]。发现在干燥的过程中的高温环境对菌株的存活有非常大的影响，因此对干燥的过程要进行优化。

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