论文总字数：15819字

摘 要

随着PCR检测技术在检测食品中动物源性成分时越来越多的被利用，为本研究—鱼肉的定性PCR方法的建立，提供了可行的理论与技术支持。通过对鱼类线粒体16S rDNA序列的研究，设计并筛选5对具有鱼源性特异性的引物，通过对5对引物的反复验证，最终PCR特异性检测结果显示，引物NC-617/642F和NC-692/714R与猪，牛，羊，鸡和鸭等成分无交叉反应，具有良好的特异性。根据灵敏性检测结果显示，该引物可以检测到0.5%的鱼源性成分。本研究方法的建立为食品中鱼源性成分的PCR检测提供了依据。

关键词：PCR；鱼源性成分；检测

Establish fish qualitative PCR methods

Abstract

With PCR detection technology increasingly being used in the detection of food products of animal origin ingredients, This study - the establishment of fish qualitative PCR method provides a feasible theory and technical support. Through the study of fish mitochondrial 16S rDNA sequences, Design and selection of 5 with fish source sex specificity primer, Five pairs of primers by repeated verification, eventually the PCR specificity tests showed, Primer NC-617 / 642F and NC-692 / 714R and pigs, cattle, sheep, chickens and ducks and other ingredients no cross reaction with good specificity. According to the sensitivity of the test results showed that the primer can be detected to 0.5 percent of the fish-derived ingredients, the fish in the establishment of a research method for food source sex composition of PCR detection provides the basis.

Keywords: polymerase chain reaction (PCR); fish-derived component; detection

目录

摘 要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1 研究背景 1

1.2 PCR检测技术 2

1.2.1 PCR检测技术简介 2

1.2.2 PCR检测技术的相关应用 2

1.2.2.1 PCR检测法在检测饲料中肉源性成分时的应用 2

1.2.2.2 PCR检测法在海洋食品中鱼类物种鉴定的应用 3

1.3 研究目的及意义 3

第二章 实验材料与方法 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验样品 5

2.1.2 主要实验试剂 5

2.1.3 主要仪器设备 5

2.2 实验方法 6

2.2.1 样品DNA提取 6

2.2.2 样品DNA浓度及纯度的测定 6

2.2.3 引物设计 7

2.2.4 反应体系和反应条件 7

2.2.5 退火温度优化 7

2.2.6 引物浓度优化 7

2.2.7 引物特异性检测 7

2.2.8 方法灵敏度检测 7

2.2.8.1 肉样水平检测 7

2.2.8.2 DNA水平检测 7

2.2.9 PCR扩增产物电泳检测 8

第三章 结果与讨论 9

3.1 引物设计结果 9

3.2 引物应用结果 9

3.2.1 引物退火温度优化结果 9

3.2.1.1 引物1退火温度优化结果 9

3.2.1.2 引物2退火温度优化结果 10

3.2.1.3 引物3退火温度优化结果 10

3.2.1.4 引物4退火温度优化结果 11

3.2.1.5 引物5退火温度优化结果 11

3.2.2 引物1浓度优化结果 12

3.2.3 引物1特异性检测结果 12

3.2.4 方法灵敏度检测结果 13

3.2.4.1 肉样水平检测结果 13

3.2.4.2 DNA水平检测结果 14

第四章 结论与展望 17

4.1 结论 17

4.2 展望 17

参考文献 18

致 谢 20

第一章 文献综述

1.1 研究背景

随着社会的发展和人民生活水平的提高，人们对于食物的要求也越来越高，市场上也出现了越来越多的富含营养的深加工食品和动物饲料，这些深加工食品和动物饲料因为失去了原材料的外貌和口感，普通消费者很难通过观察其外貌和口感得出其中含有的真实成分。为了确保消费者的利益不受侵害，我们需要研究开发出一种快速有效的检测方法来检测食品和动物饲料中的真实成分。

在动物原料产品和加工的产品中，经常会出现成分掺假和造假的行为，为了确保加工产品的真实性，国内外的研究人员建立了牛，羊，猪，鸡，鸭，鹅等动物物源性成分的检测方法^[1-4]。例如，在2013年年初西班牙发现在宠物食品中含有狗肉的成分。该发现过程描述了PCR检测技术的应用，检测出了猫粮中含有狗肉的成分^[5]。目前对饲料中动物源性成分检测，主要以样品的组织学特性和品种的特异性生物标记物为对象，由于PCR技术的快熟发展，已逐渐被全世界各个国家采用。

PCR检测技术也越来越多的出现在食品中肉源性成分的检测，例如，在海洋食品物种鉴定时，通过PCR检测技术的应用，能够快速准确的测定出海洋食品中的肉类组织所属的物种种类，为海洋食品的监管提供了技术支持。

随着鱼类及其加工产品越来越多的出现在人们的日常饮食中，市场上也逐渐的出现大量的各种各样的鱼类及其加工产品，普通的鱼类产品，消费者可以通过外观的识别，就可以有效的区别出真假，然而鱼类深加工产品就不是通过简单的外观识别就可以辨别出真假的，这就导致鱼类深加工产品中可能出现掺假造假的行为。为了明确鱼类深加工产品中的真实成分，我们需要一种快速有效的检测方法。现在已经存在的可以用于鉴别和检测的方法有很多，例如，传统的鉴别鱼类的方法：细胞学标记法，形态标记法，生化标记法。DNA分子标记法：随机扩增多态性DNA标记法(RAPD)，限制性内切酶片段长度多态性法(RFLP），微卫星DNA法，扩增片段长度多态性法(AFLP)，种属特异性基因座PCR法。但是这些方法在检测过程或检测结果中都存在着各种不足与缺陷，因此我们急切的需要一种简单，快速，准确的检测方法来替代这些有不足和缺陷的检测方法。

为了确保食品中鱼源性成分的真实性与准确性，有必要建立食品中鱼源性成分快速有效的鉴别方法。PCR检测法因为其不需对照，特异性强，灵敏度高，操作简便，快速，成本低，不仅适用于核DNA也适用于mtDNA。PCR检测法具有对检测原料要求低的特点，适用于各种实验材料，如肌肉，组织，皮，甚至脱落毛发。可以做到种属认定,易于推广等优点。PCR检测法是本次研究检测食品中鱼源性成分的主要方法，为相关检测机构提供理论与技术支持。

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