论文总字数：16629字

摘 要

酶固定化是将酶与固相载体结合起来，将游离态的酶分子束缚于载体当中，这样的方式不仅仅有利于酶制剂的回收，提高酶的稳定性，与此同时，还会有助于稳定酶的催化构象和有利于产物的分离，也会大大的降低酶制剂的成本。本次研究将采用固相合成的方法，将具有不同等电点的聚氨基酸链接枝于载体的表面，这样就可以获得具有不同表面电荷环境的固相载体，将这些载体分别用于酶的固定化，将可以系统阐明载体表面电荷对酶构象和催化活性的影响，这对于进一步丰富人们对酶固定化技术的理解，以及酶固定化技术的优化均具有重要的意义。

关键词：固相合成 酶固定化 催化活性

Synthesis and characterization of oligopeptide modified carriers

Abstract

Enzyme immobilization is the combination of enzyme and solid-phase carrier, and the free enzyme molecules are bound in the carrier, which is helpful to stabilize the catalytic conformation of enzyme, improve the stability of enzyme, beneficial to the recovery of enzyme preparation and the separation of products. This combination will reduce the cost for enzyme preparation. In this study, solid-state carriers with many kinds of surface charge environments were obtained by grafting different isoelectric point polyamino acids onto the surface of the carriers. The carriers were used for enzyme immobilization, the effect of surface charge on the conformation and catalytic activity of enzyme will be elucidated systematically, which is of great significance to enrich people's understanding of enzyme immobilization technology and to optimize it.

Keywords: solid phase synthesis; enzyme immobilization; catalytic activity

目录

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

第二章 固定化载体的聚氨基酸修饰及表征 4

2.1 实验材料与仪器 4

2.1.1实验试剂 5

2.1.2 实验仪器 6

2.2 实验方法 6

2.2.1 肽链设计 6

2.2.2 肽链合成 7

2.2.3 Zeta电位分析 7

2.2.4 红外分析（FTIR） 8

2.3 结果与讨论 8

2.3.1载体DEG-AM的氨基酸修饰 8

2.3.2 修饰载体的表征（Zeta电位分析） 8

第三章 载体的制备及表征 9

3.1 实验材料与仪器 9

3.1.1实验试剂 9

3.1.2 实验仪器 9

3.2 实验方法 10

3.2.1 Zeta电位分析 10

3.2.2 红外分析（FTIR） 10

3.3实验结果与讨论 10

3.3.1 Zeta电位分析 10

3.3.2 红外分析 12

3.4 小结 14

第四章 总结与展望 21

参考文献 22

致谢 22

第一章 文献综述

与传统的化学催化试剂相比较而言，生物燃料具有选择多样性、适度反应、短程反应和无害环境的优势，是发展绿色化学的中心方向。酶催化的氧化反应、还原反应、水解反应、转移反应、裂解反应和其他的生物反应可以成功地替代许多复杂的有机合成方法，并可以成功地应用于精炼化学品或大宗化学品（例如丙烯酰胺、乙醇酸、1,3-丙二醇、5-羟甲基糠醛、(R),(S)-表氯醇和β-环糊精等）、药品和医疗中间体（如：如西格列汀和波普瑞韦）和食品添加剂（如：低聚果糖和半乳寡聚糖）。

酶分子是生物催化的核心，随着现代生物技术、蛋白质技术和基因工程的迅速发展，有针对性的酶和活性高的酶正在越来越多地得到广泛的研究和应用^[19]。工业环境限制了生物浓缩的工业应用，研究人员试图通过检测高耐受性酶、随机突变和酶固定来解决这些工业环境受限问题。

以物理的手段或化学的手段通过酶固定过程将游离酶分子固定在载体中，不仅仅可以稳定酶的分子构成，而且还有助于酶活性剂的稳定，它还适用于酶制剂的回收和再循环，这将会有助于反应器的开发，并且还将有助于促进生产过程的连续性，因此固定酶技术近年以来越来越多的受到研究人员的广泛关注，相关的研究是酶工程领域的研究重点。

• 1. 固定化酶概述

酶催化具有选择性强、高效性、反应条件温和等诸多的优势，如今已经应用在医药、食品、精细化妆品等方方面面，但游离酶分子一旦离开了细胞环境后稳定性也会迅速下降，而且不能够重复的使用，使其在应用于实际受到了一定的限制。我们知道，酶固定化是将游离态的酶分子束缚于载体当中，将游离酶分子与固相载体相结合，这样不仅仅有利于稳定酶的催化构象，提高酶的稳定性，同时还有利于酶制剂的回收和产物分离，大大地降低了酶制剂的成本。固定化酶的制备方法很多，大致可以分为吸附法、包埋法、化学交联法和共价结合法。

尽管目前固定化酶的种类繁复多样，但是其结构可以大致分为两个部分，一是催化部分：酶分子部分，这部分是催化反应的关键部分，酶分子的活性高低直接决定了固定化酶的催化效率高低。二是非催化部分：载体部分，这部分并没有催化活性，其作用是结合酶分子，使其便于操作和回收，载体的孔结构、比表面积和活性位点密度决定了酶的装载量。

近年以来，新型的酶固定化载体不断的涌现。依据其材质的不同可分为有机高分子聚合物材料、无机金属氧化物材料和金属有机复合材料，这些载体的表面活性高，并且具有介孔尺度的孔结构和巨大的比表面积，可以容纳较多的客体分子。现有的涉及酶固定化载体的研究大多数集中在如何提高载体的装载量，但是却忽略了一个重要的问题——即载体表面的化学性质将会对酶构象产生巨大的影响。根据固定化酶的结构可以得知，酶分子结合于载体上，实际上是处于固相载体和液相主体之间，其结构不仅仅受液相主体的影响，同时也与固相载体表面的化学性质密切相关，但现有的研究鲜有对这一问题进行系统的阐述。

因此，为了讨论固相载体表面化学性质对酶催化构象及活性的影响，必须首先构建一系列具有不同表面化学性质的酶固定化载体。为此，本研究将采用固相合成技术，在树脂表面接枝具有不同等电点的寡肽片段，研究接枝后修饰载体表面化学性质（电荷密度、电荷性质）的变化，将为后续的研究奠定基础。

• 1. 固相合成多肽概述

固相合成：Robert Bruce Merrifield在20世纪中后期提出的一种不停地添加所需序列的氨基酸于特定的固相载体上的制作多肽的方法^[15]。首先经过共价结构将氨基酸与已经备好的高分子树脂连接，在这个基础上，利用偶联反应将剩下的氨基酸按照设计的序列进行缩合连接，如果需要确定氨基酸序列是否符合所需要求，则可以按照序列要求将多肽链于树脂上脱除进行下一步精制^[17]。总的来说，这是一个利用固相载体进行偶联反应的过程，最后经过纯化精制即可得到所要求的多肽序列。 偶联反应：一个氨基酸的碳端（羧基）与另一个氨基酸的氮端（氨基）连接从而构成一个酰胺键的共价结构，将所需聚氨基酸链按设计序列合成，最终得以达到预期目的。此过程可以利用各种不同的缩合试剂促使该反应的进行，经常用到的试剂有N，N‘-二异丙基碳二亚胺（DIC）、1-羟基苯并三唑（HOBT）活化酯法接肽。 这种方法不是将载体放在溶液里面，从而避免了很多复杂的分离精制的步骤。但是其合成效率和纯度低，且只能合成序列短的多肽链，从而导致其合成的成本高。再加上其试剂毒性较大，使其在具有一定优越性的同时也存在一定的问题^[6]。虽然如此，其价值还是很优越。

• 1. 固相合成多肽方法概述

（1）Boc\Bzl(叔丁氧羰基\苄基)固相合成法

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