摘 要

α-熊果苷是一种安全、高效并且拥有非常强配伍性的天然美白活性物质。与β-熊果苷相比，α-熊果苷具有更出色的美白效果。它主要通过减少皮肤中黑色素的含量来降低皮肤中黑色素的沉淀，抑制皮肤中色斑和雀斑的出现，主要作为美白剂用于高级化妆品中。本论文开展全细胞催化法生产α-熊果苷的研究，首先构建了重组蔗糖磷酸化酶的基因工程菌E. coli BL21(pET28a-SPase)，建立了α-熊果苷的HPLC检测方法，接着优化了利用该重组菌株全细胞催化制备α-熊果苷的工艺条件，结果表明，在30 ml反应体系中，对苯二酚浓度1.6%，蔗糖浓度20%，添加500 ml发酵液所得细胞，反应60 h，α-熊果苷产量为7.31 g/L，添加抗氧化剂VC，α-熊果苷产量，较未添加前提高了28.7%。

关键词：α-熊果苷 全细胞催化 蔗糖磷酸化酶

Preparation of α - Arbutin by Whole Cell Catalytic Method

Abstract

Α-arbutin is a safe, efficient and has a very strong compatibility of natural whitening active substances. Compared with β-arbutin, α-arbutin has a better whitening effect. It is mainly through the reduction of melanin in the skin to reduce the skin melanin precipitation, inhibition of skin spots and freckles appear, mainly as a whitening agent for advanced cosmetics. In this paper, the whole-cell catalytic method for the production of α-arbutin was studied. First, the recombinant strain E. coli BL21 (pET28a-SPase) withsucrose phosphorylase overexpressing was constructed. The method of HPLC detection of α-arbutin was established. The results showed that in the 30 ml reaction system, the concentration of hydroquinone was 1.6%, the sucrose concentration was 20%, and the cells were added from 500 ml of fermentation broth. And the yield of α-arbutin was 7.31 g / L under this optimum condition. And the yield with VC added was 28.7% higher than that without VC adding.

Key words: α-arbutin, whole cell catalysis, sucrose phosphorylase

摘要 I

Abstract II

第一章 文献综述 1

1.1前言 1

1.2.1熊果苷的物理性质： 1

1.2.2熊果苷的化学性质： 2

1.3熊果苷的高效制备方法 2

1.3.1全细化转化法 2

1.3.2选题的目的及意义 3

第二章 实验材料和方法 4

2.1 实验试剂和仪器 4

2.2菌株和质粒 6

2.3培养基及培养条件 6

2. 3.1 培养基 6

2.3.2 培养条件 7

2.4 pET28a -SPase表达载体的构建 7

2.4.1肠膜明串珠菌基因组的提取 7

2.4.2 SPase基因的克隆的引物设计 7

2.4.3 SPase基因PCR反应条件及体系 8

2.4.4克隆载体的制备 10

2.5目的片段与克隆载体的连接与转化 11

2.5.1目的片段与克隆载体的连接 11

2.5.2DH5α感受态细胞的制备及转化 12

2.6蔗糖磷酸化酶的表达 13

2.7全细胞催化 13

2.7.1催化体系和条件 13

2.7.2产物液相检测 14

第三章 结果与讨论 15

3.1重组载体构建 15

3.2蔗糖磷酸化酶的表达 16

3.3全细胞催化制备α-熊果苷 17

3.3.1产物液相检测结果 17

3.3.2.细胞浓度 18

3.3. 3抗氧化剂的添加 21

第四章 结论与展望 24

4.1结论 24

4.2展望 24

参考文献 25

致谢 27

第一章 文献综述

1.1前言

熊果苷的化学名称为４-羟基苯基-Ｄ-吡喃葡萄糖苷(４- Hydrosphere- D- glucopyrano -side) 是一种来自天然绿色植物的天然活性脱色成分，属于对苯二酚苷类化合物。随着科学研究证明熊果苷是一种新兴的纯天然美白活性物质，无过敏性、对皮肤不会造成刺激并且拥有极好的配伍性（Stepanova，Belyanin et al.2014）^[1]。目前国内外对于熊果苷都有极大的需求量，熊果苷的制备在当前具有广阔的市场前景。由于熊果苷具有有效抑制酪氨酸酶的活性的功能，所以能够起到防止黑色素在皮肤中的累积的作用，并且可以很好的抑制多巴醌和多巴色素的生成。研究发现因为熊果苷具有极强的配伍性，与七叶醇等配伍时具有较好的美白作用，这为美白化妆品的开发提供了一条新的思路（Tokiwa，KKitagawa et al.2007)^[2]。

熊果苷有两种类型：α型和β型，这两种类型互为立体异构体。因为β熊果苷可以通过提取等方式从熊果、小麦等植物中得到。而美白效果更好的α-熊果苷通常只能通过酶转化法使用单糖或二糖与对苯二酚1：1反应生成α-熊果苷。通过研究两种构型的熊果苷对皮肤中黑色素细胞的影响，根据对比实验发现α-熊果苷是β-熊果苷对皮肤的美白效果的10倍以上。并且从对皮肤的美白机制来看，α-熊果苷的美白方式是利用对酪氨酸酶这种物质活性的抑制，但对人体细胞的正常生长存活不会产生影响和负面作用。但是β-熊果苷却会抑制人体细胞的正常存活，对消费者生理产生一定的副作用^[2]。所以综合来看α-熊果苷是一种安全性更高、美白效果更好的添加剂。最初发现熊果苷时是存在于熊果的叶子中，随后熊果苷又慢慢在不同科以及同科不同属的植物的叶子和果实中被发现。

1.2.1熊果苷的物理性质：

分子式：C12H16O7，分子量：272.25，结构式如图1-1：

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