井冈霉素延缓埃及伊蚊发育并阻止其飞行(双翅目:蚊科)

作者：Andrew D. Marten,¹ Alicyn I. Stothard,² Karishma Kalera,² Benjamin M. Swarts, ² and Michael J. Conway ^1,3

摘要Marten AD, Stothard AI, Kalera K, Swarts BM, Conway MJ. Validamycin A Delays Development and Prevents Flight in Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. 2020 Jul 4;57(4):1096-1103.

海藻糖是一种二糖，是昆虫血淋巴液中发现的主要糖。海藻糖提供能量，促进生长、变态、应激恢复、几丁质合成和昆虫飞行。海藻糖的水解是在海藻糖酶的酶控制下进行的。海藻糖酶在昆虫生理中起着至关重要的作用，是调节代谢和葡萄糖生成的必需酶。海藻糖酶抑制剂是一类尚未完全开发的新型杀虫剂。在这里，我们测试了海藻糖类似物在一种重要的病媒——埃及伊蚊中作为杀幼虫剂或杀成虫剂的能力。研究表明，井冈霉素A而不是5-硫海藻糖能延缓幼虫和蛹的发育，并能阻止成蚊的飞行。用井冈霉素A处理的幼虫血糖降低，蛹海藻糖含量增加。治疗方法还使蚊子的性别比例向雄性蚊子倾斜。这些数据表明，井冈霉素A是一种杀虫剂，可以损害一种重要病媒的发育。

关键词：海藻糖、杀成剂、埃及伊蚊、蚊、发育

海藻糖是一种非还原性二糖，是昆虫血淋巴液中的主要糖 (Wyatt and Kale 1957)。海藻糖提供能量，促进生长、变态、应激恢复、几丁质合成和昆虫飞行 (Katagiri et al. 1998; Xia et al. 2002; Wegener et al. 2003, 2010; Liebl et al. 2010; Thorat et al.2012; Tatun et al. 2014; Shukla et al. 2015; Tang et al. 2017; Wolberet al. 2017; Zhang et al. 2017)。海藻糖的水解是在海藻糖酶的酶控制下进行的。海藻糖酶在昆虫生理中起着至关重要的作用，是调节昆虫代谢和葡萄糖生成的必需酶(Shukla et al. 2015)。

以前的研究表明，海藻糖是由保守的酶在脂肪体内合成的(Murphy and Wyatt 1964, Beckeret al. 1996)。这些储存的能量被海藻糖酶水解，以满足发展和飞行的能量需求 (Wegener et al.2010)昆虫海藻糖酶有两种形式，海藻糖1 (tre1)是可溶性的，从血淋巴、中肠杯状细胞和卵中纯化得到。海藻酶2 (Trehalase 2)是一种膜结合形式，已在飞行肌、卵泡细胞、卵巢细胞、精包、中肠和脑组织中被鉴定 (Shukla et al. 2015)。海藻糖酶是唯一负责水解海藻糖的酶，这使得它成为一个有吸引力的分子靶点。

海藻糖是一种重要的糖，抑制其代谢对昆虫来说是致命的(Shukla et al. 2015)RNAi研究表明海藻糖酶的沉默会导致褐飞虱的体重下降、正常生长发育缺陷以及死亡。(半翅类:Delphacidae)(Chen et al.2010b)RNAi的研究也导致了甜菜虫(Spondoptera exigua)的异常发育 (Chen et al. 2010a)。向昆虫幼虫注射海藻糖酶抑制剂如井冈霉素A，曲唑啉也会导致不成功的蛹化和致命的成虫变态(Xia et al. 2002;Liebl et al. 2010; Wegener et al. 2003, 2010)抑制海藻糖代谢也阻碍家蚕的卵发育(家蚕科)(Katagiri et al. 1998)。海藻糖代谢抑制导致飞蝗飞行肌低血糖，干扰正常几丁质合成(直翅目:蝗科)(Wegener et al. 2003, 2010; Liebl et al.2010)。黑腹果蝇(双翅目:果蝇科)和蚊子也使用海藻糖作为应激(Thorat et al. 2012)，当埃及伊蚊尚为幼虫时，井冈霉素A已被证明可以抑制其飞行 (Logan 2005)。

海藻糖代谢是开发新农药的一个明显目标。这种糖在人类或其他脊椎动物体内无法合成，海藻糖酶缺乏是一种轻微疾病，可以通过饮食的微小改变(比如不吃蘑菇)来解(Richards et al. 2002)。将海藻糖酶抑制剂作为一种靶向药物这一策略将对人类和其他脊椎动物产生最小甚至不存在的影响。海藻糖可被细菌、真菌和节肢动物积极利用(Arguelles 2014)。井冈霉素A是一种海藻糖酶抑制剂，具有抗生素和杀菌剂的作用，用于防治土壤传播的疾病，如水稻、土豆和蔬菜中的丝核菌(Rhizoctonia solani,Cantharellales:Ceratobasidiaceae)，以及抑制蔬菜幼苗中的疾病(Asano et al.1987)海藻糖酶抑制剂对生态系统的较大生态影响尚未得到评价。

由于海藻糖在昆虫生理学中的重要作用，已经提出了几种海藻糖模拟物和类似物作为杀虫剂(Shukla et al. 2015, Orsquo;Neill et al. 2017)。这些抑制剂是化学上的亚氨基糖或伪糖。它们都是海藻糖酶催化位点的竞争性抑制剂，可阻断微摩尔中海藻糖酶的活性，使其发生亚微摩尔排列(Shukla et al. 2015)，一种很有前途的海藻糖拟物是5-硫海藻糖，它能有效地防止艰难梭菌利用海藻糖 (Danielson et al. 2019)。我们假设海藻糖拟态物在病媒中可以作为杀幼虫剂或杀成虫剂。

埃及伊蚊是一些重要的全球人类病原体的主要媒介，包括登革病毒(DENV)、寨卡病毒(ZIKV)和基孔肯雅病毒(CHIKV)(Conway et al.2014)。目前还没有针对这些病毒的靶向抗病毒药物，由于可能引发抗体依赖性增强(ADE)，目前批准的DENV疫苗仅限于一小部分人群(Conway et al. 2014, Sridhar et al.2018)。需要新的和安全的杀虫剂。在美洲、非洲和亚洲发现了对氨基甲酸酯、有机氯、有机磷和拟除虫菊酯的新抗药性(Moyes et al. 2017)。

在这里，我们发现海藻糖酶抑制剂井冈霉素A ，而不是5-硫海藻糖。埃及蚊幼虫和蛹的发育和防止成年蚊的飞行。井冈霉素A治疗降低了幼虫的葡萄糖水平，增加了蛹的海藻糖水平，这表明发育和飞行的延迟至少部分是由于低血糖。当蚊子在卵或早期幼虫阶段被治疗时，井冈霉素A治疗最有效，而一旦蚊子发育成蛹就无效了。也许是由于数量的增加， 井冈霉度A也使雄蚊的性别比例发生了倾斜。

材料与方法

蚊子和试剂

埃及伊蚊(洛克菲勒品系)由康涅狄格州农业实验站(康涅狄格州纽黑文)提供。按标准饲养方法(光周期12:12 (L:D) h)饲养成蚊，温度27℃，湿度80%。蚊子以麻醉的繁殖鼠为食来生产卵(中密歇根大学IACUC批准# 18-30)。将卵收集在滤纸上，保存2周后用于实验。 井冈霉素A来自开曼化学公司(Ann Arbor, MI)。海藻糖取自Millipore Sigma (Burlington, MA)。 井冈霉素A可溶于140克/升的水中。海藻糖的水溶性可达50克/升。

卵、化蛹和羽化试验

每个试验条件下，在200 ml的培养基中孵化3个容器，共约100枚卵。饲养介质的制备方法是:将肝粉(完美补充剂):活性干酵母(红星)的2%溶液加入反渗透水中。试验条件包括:完全饲养培养基、只添加肝粉的完全饲养培养基、添加井冈霉素A 0.1、0.2、0.5 mg/ml的完全饲养培养基和添加井冈霉素A 的完全饲养培养基0.2 mg/ml海藻糖，5-硫海藻糖0.1 mg/ml的完全饲养培养基。其中一项实验仅用含肝粉的培养基孵化卵并喂养幼虫。幼虫在上述实验条件下处理，直至发育成蛹。另外，每隔一天用5 ml 1%的完全培养液喂养幼虫，直到所有幼虫发育成蛹。幼虫和蛹在27℃、80%湿度和12:12 (L:D) h光周期的相同环境中发育。每个试验条件下，测定7 d以内的孵化率。用任一发育阶段的幼虫总数除以培养基中添加的总卵数计算孵化率。在所有幼虫发育成蛹或剩下的幼虫发育成蛹之前，确定化蛹率幼虫死亡。蛹化蛹率是用容器中发育的蛹总数除以幼虫总数得出的。在所有蛹发育成成虫之前，测定羽化率。羽化率的计算方法是将容器中发育的成虫总数除以蛹总数。通过收集和计数飞蚊的数量来确定飞蚊的比例，并通过计算停留在水面上的成虫数量来确认这一观察结果。

5-脱氧-5-硫alpha;，alpha;-D-海藻糖合成 （5-硫海藻糖）

1. 硫代tre的合成是使用TreT催化进行的，基本上如前所述(Danielson et al. 2019)。在15 ml锥形管中加入20 mM 5-硫代d -葡萄糖(15.4毫克,CarboSynth)。40 mM udp -葡萄糖(Abcam, Cambridge, MA)， 20 mM MgCl₂ 。加入Tris缓冲液(50 mM Tris, 300 mM NaCl, pH8.0)中的TreT，如果需要，再加Tris缓冲液，最终体积为4 ml，最终蛋白浓度为10 M。反应在70℃孵育，以300转/分摇动1小时，然后将试管置于冰上冷却。将Amicon Ultra-15离心过滤装置(标称分子量限制为10 kDa)用3ml去离子水(DI)预处理3次，3,900 g离心20分钟，去除膜中的微量甘油。将冷却的酶反应混合物转移到预浸离心过滤装置后，以3,900 g纺丝20分钟。离心过滤装置上室用3ml去离子水冲洗2次，以相同的速度和时间再次离心。离心式过滤单元上腔去除后，将混合床离子交换树脂(3 g Bio-Rad Bio-Rex rg501 - x8)加入管中，在室温下搅拌1 h。然后过滤上清液。剩余的树脂用5ml去离子水冲洗两次，上清液过滤并与剩余的产品结合。后期薄层析使用正丁醇，无水乙醇和去离子水 5:3:2 的比例配制评估葡萄糖类似物向海藻糖类似物的转化。对纯化产物进行浓缩旋转蒸发给予5-ThioTre(21.8 mg, 77%).产物的1h和13c核磁共振谱与文献相符。 1 HR ESI MS负向模式：已计算。为C₁₂ H₂₂ClO₁₀S[M Cl] minus; m/z, 393.0622;found, 393.0606.据预测，5- thiotre的水溶性与海藻糖非常接近，并在100 mM处产生储备。

葡萄糖和海藻糖测定

卵是在井冈霉素A浓度为0.1, 0.2, 和 0.5 mg/ml 的完全培养基中孵化的。制作三个平行，其中有3个4龄的幼虫和最近发育的蛹，方法是用滤纸干燥昆虫，然后将昆虫加入100个磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。每个池均质使用Argos Technologies杵马达搅拌机，然后通过Qiashredder (Qiagen, Hilden,德国)去除不溶性碎片。使用市售海藻糖分析试剂盒(Megazyme，芝加哥，IL)评估了少量粗解物中葡萄糖和海藻糖的存在。在这个实验中，海藻糖酶催化海藻糖分解产生两摩尔葡萄糖，葡萄糖被己糖激酶转化为葡萄糖-6-磷酸(G6P)，而葡萄糖-6-磷酸又被G6P脱氢酶氧化为葡萄糖酸-6-磷酸。后一步涉及辅助因子NADP^＋ 同时还原为NADPH，这可以通过增加340 nm处的吸光度来测定。根据试剂盒说明书，在96孔平底酶标板上进行检测，并进行了轻微修改将等量的粗裂解液样品与除海藻糖酶外的所有检测试剂盒组分在37℃下孵育1小时，在340 nm处测定吸光度，以确定样品中葡萄糖和G6P的基线水平(图6中的G)。接下来，在相同的样本中加入海藻糖酶，在37℃下孵育1小时，在340℃下测定吸光度(图6中的T)。加入海藻糖酶后吸光度的任何增加都是由于海藻糖的存在。缺少粗裂解液的PBS对照纳入分析(阴性图6)。使用Tecan平板阅读器(由Tecan iControl软件操作的Infinite F200或M200PRO)测量340nm的吸光度。在所使用的条件下，线性度得到了证实。

结果

井冈霉素A延迟埃及伊蚊发育和阻止飞行

为了检验井冈霉素A对白纹伊蚊是否有杀幼虫或杀成虫的作用。我们处理了大约100批蚊。用0、0.1、0.2和0.5 mg/ml井冈霉素A处理埃及伊蚊卵，测定其孵化、化蛹和羽化率。井冈霉素A以剂量依赖的方式延迟卵的孵化、化蛹和羽化，并具有轻微的杀幼虫作用(图1A-C)。0 mg/ml井冈霉素A时，未观察到幼虫死亡率。观察幼虫死亡率7%至0.1和0.2毫克/毫升井冈霉素A和观察幼虫死亡率为0.5毫克/毫升9%井冈霉素A .井冈霉素A显著降低了成年蚊子的比例，蚊子的存活率呈剂量依赖性，以0.5 mg/ml浓度饲养的蚊子100%不能飞(图1D和E)。有趣的是,井冈霉素A处理后的成虫性别比例偏向雄性，0.2 mg/ml井冈霉素A处理后的成虫未发现雌性成虫(图1F)。

图1所示。井冈霉素A可以延缓埃及伊蚊的发育，阻止其飞行，并改

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