Cer-zh编码的beta;-酮酰辅酶A合成酶HvKCS1在大麦叶蜡合成和大麦白粉病萌发中发挥关键作用

原文作者 Li Chao等 单位 中国科学院西北生态环境与资源研究所植物胁迫生态生理与生物技术实验室等

摘要：植物表皮主要覆盖在陆地植物的表面。它由角质层和蜡质组成，可以抵御干旱、病原体和食草动物。酰基表皮蜡质是通过延长复合物合成的。延长复合物在下游的修饰途径中将脂肪酰基前体延伸到38个碳，。21个大麦Eceriferum（cer）突变体的叶片完全缺乏表皮蜡质晶体，这使得这些突变体成为识别延长和修饰途径生物合成基因的极好工具。cer-zh突变基因的位置克隆鉴定了一种延长酶组分，3-酮酰基-COA合成酶（CER-ZH/HvKCS1），它是由大麦基因组编码的34种同源KCS之一。通过蜡质和角质层分析以及酵母异源表达，推导出CER-ZH的生化功能。这些实验表明，CER-ZH/HvKCS1对C₁₂~C₁₆具有底物特异性，尤其是对不饱和的酰基链，因此在蜡质生物合成的总酰基链延伸中起着重要作用。还评估了CER-ZH对角质层保水屏障特性的影响以及对大麦白粉病真菌萌发的影响。

关键词： beta;-酮酰辅酶A合成酶、禾谷类白粉菌、表皮蜡质、大麦、超长链脂肪酸

介绍：

角质表皮覆盖在陆地植物的外表面，提供了一个强有力的水屏障，保护嫩芽不受干旱胁迫，并排斥表皮的水和微粒。表皮也是抵御病原体和食草动物的第一道防线，并反射有害的紫外线辐射。它由角质层和表皮蜡质两个主要成分组成。角质是由长链脂肪酸和甘油通过酯键连接而成的氧化复合物。角质基质嵌入并覆盖表皮外细胞壁，提供表皮的结构主要成分。角质层渗透并覆盖以酰基脂族为主的表皮蜡质，包括修饰超长链脂肪酸（VLCFA）和聚酮类脂族。在某些植物表面，角质蜡形成复杂的蜡晶体；这些表皮晶体形成相关器官表面白霜的外观，并有助于反映表皮特性。

由于角质层对植物健康的重要性，人们对角质蜡进行了深入的研究。此外，表皮还提供了一种研究植物生物学中广泛关注的相关过程的方便方法，如分泌和VLCFA合成。蜡质缺失（cer）突变体，外表皮蜡质晶体很少或完全缺失，可以很容易地选择和用于分析表皮蜡代谢、调节或分泌的过程，并研究应激现象。大麦器官和拟南芥茎是两种广泛开发的系统，都有明显的表皮蜡质，以及使其适合于鉴定和鉴定参与表皮蜡生物合成的核心酶的基因组资源。79个已鉴定的大麦CER基因中的3个，即Cer-c、-q和-u，最近被克隆并证明属于一个101 kb的基因簇，编码三种参与合成蜡聚酮的酶。通过对大麦半生物营养化病菌抗性增强的筛选，确定了大麦蜡质生物合成机制的另一个组成部分，即emrl，它携带了编码beta;-酮酰辅酶A合成酶（KCS），hvKCS6。emrl/hvkcs6突变导致总表皮蜡质含量显著减少，并且该突变导致蜡质成分中26个碳长或更长的碳链特别缺乏。有趣的是，这种基因的突变在大麦cer突变体集合中没有发现，这表明该集合是不完整的。缩合酶如HvKCS6在VLCFA表皮蜡质前体的合成中起着核心作用。VLCFA被位于内质网中的脂肪酸延伸酶复合物延长。

这个过程至少需要四种催化活性。KCSS催化延伸过程中，首先将酰基CoA（N）与丙二酰CoA缩合，得到beta;-酮酰辅酶A（N 2）。随后，beta;-酮酰辅酶A的酮基被其他酶还原、脱水和再次还原，形成比初始底物长两个碳的酰基辅酶A。KCS是已知为底物特异性的延长酶的唯一组分。因此，植物基因组倾向于编码许多具有不同底物特异性和表达谱的KCS，这为不同下游产品（包括表皮蜡、鞘脂、种子油和亚胚层）合成不同长度的VLCFA提供了原料。

在拟南芥中，已经鉴定出21个假定的KCS基因，到目前为止，已经证明其中6个基因有助于酰基表皮脂质生物合成：KCS1、KCS2/DAISY、KCS6/CER6、KCS10/FDH、KCS16和KCS20。另外5个，KCS3、KCS5/CER60、KCS8、KCS12和KCS19，在年轻干表皮细胞中有高表达。它能有效地产生表皮蜡质，但目前还没有证实这些蜡质具有生理功能。因此，在拟南芥中至少有6种KCS，可能多达11种，在植物发育过程中或在对外界环境的反应中进行细微调控蜡质的生产。拟南芥在利用大量KCS酶生产表皮蜡质方面不太可能是独一无二的，因为迄今为止，KCS基因家族在不同的植物分类群中占有很大的地位。大麦emrl/kcs6表皮蜡质缺乏，但并非完全缺乏，长于24个碳的酰基脂肪族化合物明确表明KCS酶比HVKCS6更多，有助于该物种蜡质前体的延伸，这与早期的生物化学研究相一致。

通过对携带导致大麦cer-zh突变体，其蜡质缺乏表型损伤的基因位置克隆，证实了这确实是一种情况，因为cer-zh被证明编码一种新的3-酮酰CoA合酶，即HvKCS1。从cer-zh.54突变体的蜡质和角质层分析及其在酵母细胞中的异源表达，推导出HvKCS1的生化功能。研究了HvKCS1对大麦白粉病对角质层水屏障特性的影响及其在孢子萌发中的作用。结果揭示了KCS的分工，以及这种分工对表皮蜡质组分链长分布的影响，以及VLCFA前体在不同下游用途中的分配。此外，这一结论还增加了大量文献，阐明了KCS蛋白家族底物特异性与酶混交的研究。

结果

CER-ZH突变对大麦白粉病侵染结构的影响

虽然所有cer-zh突变体的选择都是因为它们的光面叶片，它们也是半矮秆，如图1、A和B所示。此外，抽穗晚，高度不育，特别是在野外。光滑的表型推断出表皮有缺陷，可以想象其改变了叶片表面保持水分的能力。因此，研究了叶片的保水力及其失水率。图1c表明，与野生型Bonus相比，突变体的失水率（44%；plt;0.05）略有增加，但具有显著性差异。图1D公开了突变体在喷施数分钟后仍被水滴覆盖，而喷施在野生型Bonus叶上的水滴则立即流出。这是cer-zh有光泽、蜡质缺失表型的明显迹象。

对具有缺陷表皮的其他突变体的分析表明，大麦白粉病感染叶片的能力可能受到表皮成分变化的影响。用光学显微镜观察了cer-zh.54初生叶和野生型Bonus植株接种后16h的bgh孢子发育情况。Rubiales等人根据不同真菌结构的连续形成来区分（图ie），描述的五种不同的感染类型。未发芽的分生孢子归入第一类。第二类包括用初生芽管和次生芽管发芽的分生孢子，但没有进一步发育。分生孢子已经发芽，但比通常的两个芽管表现更多的分生孢子属于第三组。感染进展到成熟的部位梭菌被分为第四类，那些在其附着物中表现出罕见的第二分支的梭菌被分为最后一类。最后一组感染部位被解释为真菌建立吸器的第一次尝试失败，随后是同一附着体的第二次成功渗透事件。在比较cer-zh.54和野生型Bonus植物之间每类感染位点的频率时。除最后一类外，所有的孢子都存在显著差异；分生孢子的萌发在数量上受变异叶的影响，其中20%以上的孢子未能萌发。与野生型Bonus植物相比，这种减少的发芽导致突变植物上具有成熟附着体的感染部位的频率同样降低。直到取样调查的时间点，真菌以一个或多个单位萌发的感染部位多胚芽管，但没有形成附胞，也发现在突变体植物感染率显著较高。在这些部位，感染过程似乎减慢而不是停止。在孢子萌发成功的时候，真菌的感染似乎进展正常，并导致正常大小的白粉病脓疱。总的来说，这些结果表明cer-zh.54突变对叶片表面Bgh感染结构的发展有很强的影响。

CER-ZH突变改变了蜡质的晶体结构、蜡质的负荷和蜡质的组成。

用扫描电子显微镜（SEM）观察蜡的晶体结构。野生型Bonus和其他禾本科植物的表皮蜡层中含有大量的C_26-32初级醇，具有特征性的致密排列，甚至在叶背面和叶正面覆盖小晶体。相比之下，突变体cer-zh.54具有分布不均匀的蜡晶体，使大面积的区域没有这些结构（图2）。所选图像显示了代表性气孔，也提供了蜡晶体大小的相对参考；特别是，蜡晶体的斑片状分布在表皮细胞类型上是一致的。蜡晶体覆盖率的显著下降与目前观察到的蜡质含量减少以及之前报告的接触角显著下降密切相关。对几种大麦突变体的蜡质结构进行了初步研究和命名，即cer-j.59、-p.37、-yp.949、-za.126、-zd.67、-ze.81和-zj.78。它们都没有与cer-zh.54相同的表型。有趣的是，cer-zh.54（如下所述）和cer-j.59突变体的主要醇类的大量减少，产生了明显不同的外皮蜡层。

蜡质负荷测定显示，cer-zh.54仅累积了野生型Bonus蜡质负荷的24%。这76%的减少量远远大于先前研究报告的该突变体约52%的减少量。生长条件和取样步骤的差异可能导致观察结果之间的差异。除cer-j.59外，本文观察到的cer-zh.54的蜡质负荷比其他研究的任何大麦CER叶片突变体减少得更严重，其蜡负荷降低了74%。

薄层色谱法（TLC）和气相色谱-质谱法（GC-MS）分析揭示了Bonus和cer-zh.54蜡质（si）中碳氢化合物、酯类、醛、伯醇和脂肪酸以及烷基间苯二酚和未知物的预期存在。当在cer-zh.54和Bonus中检测TLC显示的蜡类的相对比例时，突变体中的酯类数量增加，而原醇数量减少。这也是从Zabka et AVS（2008）总体成分分析中推断出来的。本研究中GC火焰离子化检测器（FID）数据得出的定量差异如图3a所示；即，C₂₆一级醇从752减少到150mu;g dm^-2，C₄₂链长度占酯类的主导地位。从6增加到29mu;g dm^-2。这两个变化都非常显著。Bonus中的C₃₈-C₅₂酯总计65 mu;g dm^-2和cer-zh.54 56mu;g dm^-2。就痣而言，突变体中的酯类占Bonus的87%。这表明，突变似乎并没有实质性地影响到酯类的前体数量，但只影响到酯类的合成类型。这一结论与酯类的GC-MS一致，例如，显示两个基因型中的C₄₂酯类均以C₁₆脂肪酸和C₂₆一级醇异构体为主（图4）。少量其他两种异构体（C₁₈脂肪酸加上C₂₄一级醇和C₂₀脂肪酸加上C₂₂一级醇）存在于Bonus中，而前者也存在于cer-zh.54中。这与以下发现一致：在Bonus野生型中，较短的酯醇部分C₂₀、C₂₂和C₂₄至少占总量的15%。没有进行详细的研究来探索可能存在的其他小异构体。除了六种初级醇和八种酯同系物外，蜡中还鉴定出19种其他脂肪族化合物。GC-FID痕迹中未识别的成分分别占Bonus和cer-zh.54蜡质重量的6.1%和9.1%。

CER-ZH突变引起角质成分和负荷的变化

对cer-zh.54突变体和野生型突变体的可水解氧化角质单体的含量和组成进行了分析。额外的角质含有两种典型的C₁₆角质单体，包括共羟基十六烷酸和10,16-二羟基十六烷酸，以及带有共羟基十八烷酸和9,10-环氧树脂的C₁₈角质单体，18-羟基十八酸大量积累。cer-zh.54突变体角质层含有相同的部分，但是OH-C₁₆和10,16-diOH-C₁₆（分别为50%和20%）的含量越高，C₁₆单体的总含量增加了25%，达到20mu;g dm^-2。两个基因型中C₁₈单体的数量几乎相同。因此，在C₁₆单体中，cer-zh.54有一个小但显著的增加（plt;0.01），而总角质层负荷的小增加并不显著。虽然ce

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