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摘 要

随着基因工程技术的研究和发展，转基因农产品的市场化趋势已越来越明显，国家也采取相应措施对转基因产品加以管理。目前对转基因产品外源基因的检测多集中在启动子、终止子、目标基因和标记基因上，本文通过使用常用的启动子CaMV35S对待测样品进行定性和定量检测，从而对待测样品是否含有该启动子进行定性及定量分析。

关键词： 水稻，转基因，定性检测，定量检测

Abstract: Because rising of genetically engineered technology, the market trend of Transgenic Agricultural Products has become more and more obvious, the country also take corresponding measures to regulate genetically modified products. At present, the detection of transgenic products of exogenous genes more concentrated in the promoter, terminator, target gene and marker gene. In this paper, through the use of commonly used promoter CaMV35S for qualitative and quantitative detection of sample to be measured, and thus the sample to be measured is containing the promoter of qualitative and quantitative analysis.

Keywords: Rice, Transgenic, Qualitative PCR, Quantitative PCR

目 录

1 前言 5

2 材料与方法 5

2.1 材料 5

2.2 试剂与耗材 6

2.3 仪器设备 6

2.4 方法 6

2.4.1 DNA的提取与纯化 6

2.4.2 引物序列 7

2.4.3 PCR检测 7

3 结果分析 8

3.1 定性PCR检测 9

3.2 实时荧光定量PCR检测 9

结 论 10

参 考 文 献 11

致 谢 13

1 前言

随着转基因作物产业化，市场化的进程不断加快，人们对转基因作物的环境安全性和食品安全性问题的关注也越来越多，基于对转基因产品进行安全监管及保护消费者知情权的需要，对转基因产品进行检测的需求也日益增多^[1]。

目前，转基因生物检测技术主要分为两大类，一类是基于外源基因表达的蛋白质检测技术，另一类是基于核酸的检测技术^[2]。由于DNA的稳定性，基于核酸的检测技术几乎适用于所有种类的样品，如原料、加工品及饲料等。常用的核酸检测方法包括PCR检测技术、等温核酸扩增检测技术、基因芯片检测技术、新型转基因核酸检测技术和高通量测序等^[3]。

PCR检测技术通过对目标序列进行扩增，然后利用不同方法对扩增的产物进行检测。按照能否进行定量分析，常见的PCR检测方法又分为定性PCR、复合定性PCR、PCR-ELISA、竞争性定量PCR以及实时定量PCR^[4]。PCR检测技术以其特异性高、快捷、简单、安全、灵敏等特点而成为转基因植物及产品检测的常规技术，主要用于DNA水平和RNA水平(RT-PCR)的检测^[5]。

转基因产品的PCR检测可以判断待检样品中是否含有外源转基因成分。目前有定性和定量的检测方法，对转基因产品安全性检测主要集中在对转基因产品的筛选标记基因、启动子、终止子等的检测。

CaMV35S启动子是花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)，双链DNA病毒基因组中启动35S RNA基因转录的启动子。CaMV35S启动子是一个组成型启动子，不仅能在双子叶植物中高效启动基因表达，而且在许多单子叶植物中也可以发挥作用^[6,7]。另外CaMV35S启动子内部无常见的酶切位点，因此容易克隆和使用，在植物基因工程中得以广泛应用。

本研究以水稻品系为试验材料，分别采用定性及定量PCR方法，对CaMV35S启动子基因进行检测分析，来判断该水稻是否为含有转CaMV35S启动子基因的转基因产品。

2 材料与方法

2.1 材料

阳性质粒DNA(含有CaMV35S基因)，待测样品为水稻颗粒均有由老师提供。

2.2 试剂与耗材

DNA抽提试剂盒、定性PCR用Taq酶、dNTP、MgCl₂、定量PCR用2x GoldStar TapMan Mixture(with ROX)、电泳用DNA ladder maker均由康为世纪公司提供。定性及定量PCR引物、探针均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

2.3 仪器设备

普通PCR扩增仪、实时荧光PCR扩增仪、电泳槽及电泳仪等电泳装置、凝胶成像系统等。

2.4 方法

2.4.1 DNA的提取与纯化

操作步骤

1. 将水稻颗粒使用美的搅拌机（MJ-BL25B2）粉碎成粉末状，称取 0. 2 g粉末装入液氮预冷的2mL离心管中，加入400μl Buffer GF1和4μlRNaseA(100mg/ml)，涡旋振荡1分钟，使其充分裂解。
2. 65℃孵育10分钟，期间涡旋混匀2~3次。
3. 加入130μl Buffer GF2，混匀，冰上孵育5分钟。
4. 将所得液体转移到已装入收集管的过滤柱中，14000rpm离心2分钟，收集滤液。
5. 将收集管中收集到的滤液转移到一个新离心管中。
6. 加入1.5倍体积的Buffer GF3 (使用前检查是否已加入无水乙醇），充分混匀。
7. 将步骤6中所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱中，若一次不能加完 溶液，可多次转入，10000rmp离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。
8. 向吸附柱中加入500μl Buffer GW（使用前检查是否已加入无水乙醇），10000rpm 离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
9. 重复步骤8。
10. 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
11. 将吸附柱放到一个新离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50~100μl Buffer GE或灭菌水，室温放置2-5分钟，10000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。

2.4.2 引物序列

根据引物合成的原则，通过使用引物合成软件，分别合成定性及定量引物，

引物序列详见下表。

2.4.3 PCR检测

1、定性PCR扩增

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