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摘 要

通过比较两种培养基，两种诱导温度，不同的IPTG浓度和诱导时间对GASBD2蛋白在大肠杆菌BL21中的可溶性表达量的影响来确定GASBD2蛋白的最适诱导表达条件。结果表明；诱导培养基为TB培养基，诱导温度为25℃，诱导剂使用浓度为0.4 mM，诱导时间为12h时，GASBD2蛋白的可溶性表达量较高。

关键词：GASBD2蛋白，可溶性表达，条件优化

Abstract： In order to the optimal induction conditions of soluble GASBD2 protein in E.coli B121(DE3), the effects of the two medium, the two induction temperature, different concentration and different time of IPTG induction on the soluble GASBD2 protein expression were investigated. The results show that the optimal induction conditions of the soluble GASBD2 protein expression is TB medium, 0.4mM IPTG at 25°C after 12h.

Keywords：GASBD2 protein, soluble expression, condition optimization

目 录

1.前言 4

2.实验材料 5

2.1 菌株 5

2.2 主要仪器 5

2.3 主要试剂 5

2.4 培养基 5

3. 实验方法 5

3.1 菌种活化 5

3.2 不同培养基对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 5

3.3 不同诱导温度对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 6

3.4 诱导剂浓度对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 6

3.5 诱导时间对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 6

3.6 SDS-PAGE凝胶电泳 6

4.结果与分析 8

4.1 不同培养基对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 8

4.2 不同诱导温度对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 8

4.3 诱导剂浓度对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 9

4.4 诱导时间对GASBD2蛋白可溶性表达的影响 10

结 论 11

参考文献 12

致 谢 13

1.前言

大肠杆菌由于具有遗传背景清楚，容易培养，能大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体^［1,2］等特点，因此大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统^［3,2］。

然而，大肠杆菌表达系统也有局限性，当所表达的蛋白是复杂的真核来源的蛋白时，大肠杆菌常常不能将翻译出的多肽链正确折叠修饰形成蛋白质的天然构象，而是形成不溶性的无功能的包涵体^［4］。国外有研究表明，利用基因工程表达的全长蛋白形成的包涵体，复性效率不高^［5,6］，这在一定程度上影响着大肠杆菌表达系统的运用。所以，提高可溶性蛋白的表达量在生物工程中具有重要意义。

首先，培养基的组成对可溶蛋白的表达有影响。这不仅与营养成分的多少，还与pH值及葡萄糖效应等有关。营养成分影响菌体的生长，pH值影响酶的活性，间接影响可溶蛋白的表达。外源蛋白的表达显著地受葡萄糖浓度的影响，虽然葡萄糖比较适合作为菌体生长的碳源，但在诱导表达时期，需尽量保持低水平的葡萄糖，以甘油代替葡萄糖作为表达外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效应的有效途径之一^［7,8］。因此本实验中比较了主要成分为氯化钠、胰蛋白胨、酵母提取物的LB培养基和主要成分为胰蛋白胨、酵母提取物、甘油、磷酸二氢钾的TB培养基，确定优化条件。

其次，最适合大肠杆菌生长的温度在 37∼39℃之间，在此温度下表达外源蛋白极易生成包涵体^［8］，所以降低培养温度也是提高可溶蛋白表达含量的有效方法之一。在高水平表达时，新生肽链的聚集速率一旦超过蛋白折叠的速率就会导致包涵体的形成。而在低温条件下细菌生长缓慢，蛋白质合成也相应较慢，新合成的蛋白质会有更充分的时间折叠。同时降低培养温度也能降低重组蛋白降解的速率，提高重组蛋白的稳定性^［9］。不过低温也有一个限度，通常为8∼10℃，低于该温度，菌体生长将会停止。所以本实验研究了25℃和37℃两种温度下的表达情况，从而确定优化温度。

最后，诱导剂对可溶蛋白表达的影响更是不可忽视的。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）在乳糖操纵子中的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。但是化学试剂IPTG的毒副作用也必须考虑在内，培养时间的长短也影响着菌体浓度、菌液pH值等因素，所以本实验研究了IPTG浓度及诱导时间对GASBD2蛋白可溶性表达的影响。

本实验以含有质粒pET28a/GASBD2的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株为实验材料，考察GASBD2蛋白在LB和TB两种培养基、25℃和37℃两种诱导温度、不同的IPTG浓度和诱导时间下的表达情况，确定GASBD2蛋白可溶性表达的最优化条件。

2.实验材料

2.1 菌株

含有表达质粒pET28a/GASBD2的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。

2.2 主要仪器

台式冷冻恒温振荡箱，电热恒温鼓风干燥箱，超净工作台，电子天平，分光光度计，高压蒸汽灭菌锅，垂直板电泳槽及配套的玻璃板，恒温恒压电泳仪，电磁炉，脱色摇床，通风柜，凝胶成像仪等。

2.3 主要试剂

1M IPTG、50μg/ml Kana、30%(W/V)丙烯酰胺、l.5M Tris-HCL(pH8.8)、10%(W/V)过硫酸铵、5×Tris-Glycine buffer(SDS-PAGE电泳缓冲液)、5×SDS-PAGE loading buffer、TEMED、考马斯亮蓝R-250染色液、考马斯亮蓝染色脱色液、结合缓冲液、4M 咪唑、洗脱缓冲液、20%乙醇(树脂保存液)、5×Tris-Glycine buffer(NADE电泳缓冲液)、5×NDAE loading buffer Ni² -NTA购自于Novagen公司，IPTG、Kana、考马斯亮蓝R-250、聚丙烯酰胺、过硫酸铵、咪唑购自于南京天为公司、玉米淀粉购自于Sigma公司。

2.4 培养基

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