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摘 要

从实验室提供的菌种中筛选获得高产β-CGTase的菌株BC32，对其进行发酵条件的优化。以β-CGTase活力为指标，通过单因素试验和Plackett-Burman实验，得出影响β-CGTase活力的主要因素为马铃薯淀粉，酵母膏和硝酸钠。进一步通过响应面分析法确定发酵的最佳条件：1%马铃薯淀粉、1%酵母膏、0.075%磷酸氢二钾、0.02%硫酸镁、0.4%碳酸钠、0.5%硝酸钠、0.16%接种量。

关键词：环糊精葡萄糖基转移酶，环糊精，发酵条件，优化

Abstract：The high β-CGTase producing strains BC32 was screened from the strains provided by the laboratory, and the fermentation conditions were optimized.Using β-CGTase activity as an indicator, the main factors affecting the activity of β-CGTase were potato starch, yeast extract and sodium nitrate by single factor test and Plackett Burman experiment. The optimal conditions for fermentation were further determined by response surface methodology: 0.5%potato starch, 1%yeast extract, 0.075%potassium phosphate dibasic, 0.02%magnesium sulfate , 0.4%sodium carbonate, 0.5%sodium nitrate , inoculation amount：0.16%.

Keywords：cyclodextrin glycosyltransferase, cyclodextrin, fermentation conditions, optimization

目 录

1 前言 3

2 材料与方法 5

2.1菌种 5

2.2 培养基 5

2.3 试剂 5

2.4 仪器 6

2.5 菌种筛选 7

2.6 粗酶液制备 7

2.7发酵条件优化 7

2.7.1碳源优化 7

2.7.2 有机氮源优化 8

2.7.3无机氮源优化 8

2.7.4 PB实验 9

2.7.5响应面试验 9

2.8 酶活力测定 9

3 结果与讨论 10

3.1 菌种初筛 11

3.2 菌种复筛 11

3.3 碳源种类对产β-CGTase的影响 11

3.4 有机氮源种类对产β-CGTase的影响 12

3.5 无机氮源种类对产β-CGTase的影响 13

3.6 PB实验 13

3.7 响应面分析 15

3.7.1 验证试验 17

结 论 19

参考文献 20

致谢 23

1 前言

环糊精(CD)是环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase）利用葡萄糖聚合物得到的一类非还原性环状低聚糖^{[1, 2]}。CD的种类多种多样，这是由于α-1,4- 糖苷键连接的D-吡喃葡萄糖亚基的数目不同^[3]，其中研究最多的环糊精为α，β和γ-CD， 它们分别由环连的6、7、8个吡喃葡萄糖单体构成^[4]。而具有超过8个葡萄糖单元的CD因产率低、难以纯化和成本高的问题实际应用很少^[5]。CD的化学反应和酶反应比较稳定，可以长期储存而不发生变质。CD没有还原端和非还原端，因而不具还原性，可稳定存在于在碱性介质中；但基于环糊精的糊精活性，酸可以使其生成葡萄糖和低聚糖^[6]。

图1 α，β和γ-CD的结构

如图1所示，由于CD的手性葡萄糖单元椅子构象，自身难以围绕糖苷键进行自由旋转。它的形状像具有水溶性外表面和疏水性内部的中空截头圆锥，而不是完美的圆形^{[7, 8]}。CD在其非极性口袋状中心腔中捕获疏水分子充当分子容器^{[9, 10]}，可将许多疏水性气体、液体和固体化合物包结在其独特的环状结构和疏水的内腔内形成包埋复合物^{[11, 12]}。CD 这种性质使客体分子的溶解性和稳定性等物理化学性质得到改善^[13]，使其作为分子胶囊在食品，环境工业，制药，化学工业，纺织和化妆品等诸多领域有着日益广泛的应用^[14]。

在食品工业中，CD能够提高食品着色剂和维生素的溶解性，亦可以做为食品和蔬菜保鲜的包埋杀菌剂或保鲜膜，保护色素，防潮保湿^[15]；CD已被欧盟授权认证为安全性健康膳食纤维，它能够通过降低人体内的血糖含量来成为抗肥药物的替代品^[16]。

在水污染处理方面，CD可增加有机污染物的溶解度，促进毒性物质的吸收和污染物的催化降解^[17]；在土壤修复领域，CD可与杀虫剂结合，对污染土地进行洗脱修复。

在医药工业中，CD口服后无毒性，作为医药辅剂，可以与难溶于水的药物结合成包合物以提高其生物利用度和稳定性，调控药物释放过程^[3]；当CD的空腔与药物配对结合形成包合物后，药物分子就不能与味觉受体结合，从而可以掩盖药物的刺激性味道，改善口感，减少药物对消化道的刺激性。

在分析化学研究中，环糊精可作为高效液相和气相色谱的固定相来拆分化合物对映异构体，还可以作为掩蔽剂提高电化学测定的准确度^[18]；在有机化学研究中，CD可以作为催化物质加快化学反应的进行。

在染色工艺中，CD可以降低染料的染色速率，使布料的染色均匀美观。

在化妆品领域，CD能吸收利用化妆品中的活性成分并增加其透明质感和稳定性^[19]。

图2 环糊精葡萄糖基转移酶的的催化反应

CD在工业化生产上主要采用生物酶转化法合成，化学合成的很少^[20]。CGTase基于淀粉通过环化反应生产环糊精^{[21, 22]}。如图2所示，CGTase在反应特异性方面表现出广泛多样性，不仅具有较弱的糊精活性即水解活性，能够切断淀粉分子中的连接，而且能够进行分子内（环化）和分子间（歧化，偶合）转糖基反应^{[23, 24]}。在这些反应中，环化反应是CGTase的特异性反应，通常用于CD 生产，偶合反应被认为是环化的逆反应^[25]。

CGT酶主要可分为α、β、和γ型CGT酶，即α-、β-、和γ-CGTase，通常用于α，β和γ-CD的工业生产^[9]。α、β、和γ-CD在水中的溶解度差异较大，β-CD在水溶液中溶解度最小，很容易形成结晶析出溶液，当环糊精与客体结合形成络合物后，其水溶性会下降，更易从溶液中结晶析出^[26]。因此它便于生产，价格相对低廉，得到最广泛的应用，占三种糊精总量的90%以上^{[12, 27]}。然而，对于许多工业应用来说，它仍然太昂贵。为了克服这种限制，需要降低β-CD生产成本。

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