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蚯蚓在生物炭中对CeO₂NPs的生物累积-改良土壤：同步辐射显微光谱研究

摘 要

纳米粒子与生物炭和土壤成分的相互作用可能对纳米粒子的有效性和对生物的毒性产生重要影响。在本研究中，蚯蚓(Eisenia fetida)以不同施用量[0～5% (w/w)] ，暴露于0 ～ 2000 mg/kg CeO₂NPs和生物炭(在350和600℃下热解山核 桃壳产生的生物炭)的居民或农业土壤中28天。28天后，将蚯蚓净化并分析Ce含量、水分含量和脂质过氧化。结果表明，生物炭对蚯蚓的毒性最小，但以生物炭(350℃和 600℃)为主，分别占蚯蚓体内水分含量和脂质过氧化变异的94%和84%。对于在 600℃下含有1000 mg/kgCeO₂的两种土壤，生物炭显著降低了蚯蚓组织中Ce的积累。用 350℃生物炭修饰对Ce摄取具有混合反应。用显微 x 射线荧光光谱仪(mu;-XRF)和显微 x 射线吸收近边缘结构(mu;-XANES)分析了CeO₂和生物炭暴露蚯蚓在净化12、48和72h 后的Ce定位、形态和持久性。在相同的处理条件下，以 5% BC-600(生物炭热解温度为 600℃)处理，72h后，摄入的生物炭碎片(50mu;m)与Ce吸附在肠道表面，此外，2000 mg/kg CeO₂处理和 5% 生物炭处理48 h后，Ce在蚯蚓体内仍然存在，mu;-XANES 分析表明，在蚯蚓组织内，Ce 主要以 Ce⁴ O₂形式存在，只有少数区域(2 ～ 3mu;m²)呈还原态(Ce³ )。本研究结果表明，土壤和生物炭的特性对蚯蚓体内 CeO₂ NPs 的内化有重要影响，在估算土壤中的 NPs去向和环境效应时需要考虑这种相互作用。

关键词 CeO₂；纳米颗粒；生物炭；蚯蚓；赤子爱胜蚓；土壤；mu;-XRF；mu;-XANES

1. 引言

在过去10年中，工程纳米颗粒（NPs）的生产和使用大幅增加，其应用领域包括农业、环境修复、医药、催化剂、化妆品和电子产品等。尽管在商业产品中使用NPs有许多好处，但人们仍然担心对环境的潜在影响。例如，最近的研究报告了CeO₂NPs对植物、哺乳动物和细菌的细胞毒性。在与环境更相关的条件下，仍然迫切需要评估NP行为（去向和影响），包括通过可靠和有意义的终点评估。在制造、使用和处置过程中，NPs会大量释放到环境中。据估计，2010年，全球超过有26万minus;30.9万吨的NPs生产中，63minus;91%被处理在垃圾填埋场。此外，NPs可能进入污水处理厂并在生物固体中积累。美国城市污水处理设施每年产生约710000干吨生物固体，其中约55%用土壤处理。一旦NPs释放到环境中，其高比表面积和反应性的独特特性将受到影响。NPs的指示与土壤成分（即土壤有机碳、矿物质、生物炭等）的相互作用；这些过程随后将控制颗粒聚集、有效性和毒性。例如，在水介质中的研究表明，天然有机物显著减少了CeO₂ NPs的聚集；在土壤研究中，玉米根系中铈的积累随着土壤有机质含量的增加而增加。此外，在暴露介质中添加腐殖酸（HA）可显著降低秀丽隐杆线虫中CeO₂ NPs的毒性和生物累积。另一种会显著影响NPs分布的土壤成分是黑碳。黑炭包括通过直接土地施用作为农业改良剂（生物炭）和自然或故意燃烧而存在于土壤中的生物质热解副产物。由于在蓄水能力和养分保留方面产生的积极影响，农业土壤中生物炭的施用量有所增加。生物炭的物理和化学性质取决于原料和合成条件。然而，鉴于生物炭的固有特性，特别是其高孔隙率和表面积，可能会对土壤中NPs的去向、迁移和毒性产生重大影响。先前关于生物炭与NPs相互作用的研究表明，带正电的CeO₂ NPs与生物炭表面上存在的带负电官能团存在pH依赖的异质聚集。此外，在我们小组的一项基于植物的研究中，微X射线荧光（mu;-XRF）和微X射线吸收近边缘结构（mu;-XANES）表明，暴露28天后，CeO₂ NPs与生物炭和土壤表面相关。这些结果表明，生物炭土壤改良剂将影响NPs在环境中的分布和行为。然而，生物炭minus;土壤minus;Ce0₂相互作用对暴露于陆地生物区系的影响尚不清楚。

赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）是一种表生蚯蚓，主要发现于土壤表面的凋落物中，鉴于其可能直接接触土壤中的NPs和生物炭成分，因此它是生物有效性研究的合适模式生物。此外，蚯蚓物种可以显著影响土壤的物理、化学和生物特性。例如，蚯蚓对于有机物质的合并和破碎以及矿物质养分的循环至关重要。因此，对蚯蚓种群的负面影响可能会间接影响土壤功能和植物生长。最近的报告表明，一些生物炭可能对蚯蚓产生负面影响。Liesch等人报告，在接触67.5 mg和90 mg 的生物炭后，蚯蚓（E.fetida）的死亡率和体重显著下降；相反，暴露于松屑生物炭的种群与对照组没有显著差异。另外，一些研究集中于NPs对蚯蚓的直接影响；例如，暴露于41 ～ 10000 mg/kgCeO₂NPs ，对暴露28天后的大肠杆菌物种的存活或繁殖没有影响，尽管组织学分析确实显示了通过体壁角质层损失的潜在毒性。此外，对秀丽隐杆线虫的研究显示，在线虫生长培养基平板上以 1mg/l 的浓度暴露 ceo2np (15 和 45nm)后，线虫 cyp35a2 基因(一种异生素代谢基因)的表达增加，生育力和存活率下降。 然而，NPs与陆地环境中生物炭的相互作用对土壤无脊椎动物颗粒毒性的影响目前尚不清楚。本研究的目的是评估共同暴露于CeO₂NPs（0minus;2000 mg/kg）和生物炭（热解温度为350°C和600°C）对蚯蚓（E.fetida）的影响，包括Ce积累、水分含量和脂质过氧化。此外，使用mu;-XRF和mu;-XANES技术评估暴露后蚯蚓组织中的Ce内化和物种形成，并评估几次净化后（12、48和72小时）CeO₂NPs在蠕虫中的持久性。

1. 材料和方法

2.1 CeO₂NPs悬浮液

CeO₂NPs（99.99%，小于25nm）购自Sigma-Aldrich。先前通过亮场透射电子显微镜（TEM）图像进行的表征显示，立方、锥体或双锥状CeO₂纳米颗粒的尺寸在20和200nm之间变化。用去离子（DI）水稀释至土壤中产生0、500、1000和2000 mg/kg的水平，制备CeO₂ NPs悬浮液。用探针超声仪（FB-505，Fisher Scientific）以30%振幅对悬浮液进行超声处理1分钟。

2.2 生物炭制备

如前所述，在22L箱式炉（51662-HR型）中，在350°C（BC-350）和600°C（BC-600）下，在氮气流（1600ml/min）下对山核桃壳进行4小时的热解，从而产生生物炭。将颗粒暴露于空气中2周以完成氧的化学吸附。生物炭（BC-350和BC-600）的性能通过纳米生物炭和CeO₂NPs的zeta;电位表征作为pH值的函数进行评估，并在前面介绍。简而言之，zeta;电位逐渐变为负值，达到当pH值从3增加到11时为51 mV。生物炭的元素组成（CHNSO）和挥发性物质（VM）、水分和生物炭（BC-350和BC-600）的灰分含量已在前面描述过。将生物炭添加到CeO₂NPs改良的农业和住宅土壤中，添加量分别为0%、0.5%和5%（w/w）（干重），如下所述。

2.3 土壤准备

从康涅狄格州纽黑文市康涅狄格农业试验站（CAES）顶部50 cm土层中收集了土壤（砂壤土；69.4%砂，22.0%淤泥，8.6%粘土；4.3%有机质；pH值5.9；阳离子交换容量18.6 cmol/kg；Ce为40.7plusmn;2.6 mg/kg），美国从位于美国密苏里州哈姆登的CAES Lockwood农场顶部50 cm处收集农业土壤（细砂壤土；56%的沙子、36%的淤泥和8%的粘土；1.4%的有机质；pH 6.7；阳离子交换容量为18.6 cmol/kg，Ce为21.2plusmn;0.63 mg/kg）。将两种土壤筛分至2 mm，将100g的单个部分手动与生物炭混合。添加NP-CeO₂悬浮液并充分混合，以确保均匀性。在试验期间（28天），根据需要对土壤进行浇水，以保持适当的土壤湿度水平（约为田间容量的80%）。

2.4 蚯蚓

蚯蚓 是从 Carolina Biological Supply Company (Burlington ， NC ， usa) 购 买 的 。在CeO₂ NPs处理（0、500、1000和2000 mg/kg）中添加不同生物炭水平（0、0.5和5%）（每个实验总共600条）的每重复10条蚯蚓（每个生物炭水平和NP浓度5个重复）。将蚯蚓添加到塑料容器中，塑料容器中含有100 g经生物炭[0,0.5和5%（w/w）]和CeO₂ NPs（0minus;2000毫克/千克）。收获时，从每个复制容器中取出蚯蚓，用去离子水在筛子上冲洗，以去除表面吸附的土壤和CeO₂颗粒。如前所述，蚯蚓在含有湿润滤纸的皮氏培养皿中净化48小时。48小时后，用去离子水冲洗活蚯蚓，称重，并准备进行分析，如下所述。通过在100°C下加热样品48小时，通过重量法测定水分含量百分比。

2.5 基质消化

净化后，对蚯蚓组织进行烘箱干燥（100°C，48小时），称重，并转移到含有2毫升65%硝酸的50毫升DigiPREP聚丙烯消化容器（SCP Science，Champlain，NY，U.S.A.）中。将组织样品预消化20分钟，然后在115°C下转移至热块消化器45分钟。总共添加1 mL H₂O₂，并在消化后再加热20分钟，添加25 mL去离子水，并通过电感耦合等离子体质谱(ICPminus;MS，安捷伦7500ce)进行Ce(140amu)分析。

2.6 脂质过氧化含量

如Li等人所述，通过硫代巴比妥酸（TBA）测定法测定蚯蚓组织中的脂质过氧化，并进行了轻微修改。简单地说，样品在液氮中冷冻，然后在0.1%（v/v）三氯乙酸（TCA）中均质。然后以10 000 rpm的转速离心样品10分钟，并用1.5 mL 20%TCA和1.5 mL 1%TBA在去离子水中修正上清液。溶液在95°C水浴中培养30分钟。如前所述，通过分光光度法测定所有处理中的丙二醛（MDA）。

2.7 mu;-XRF和mu;-XANES数据采集

使用mu;-XRF和mu;XANES分析暴露于5%生物炭（600°C）和0、500、1000和2000 mg/kg CeO₂ NPs改良土壤28天后净化48小时的蚯蚓中的Ce定位和形态。此外，为了评估CeO₂ NPs在蚯蚓中的持久性和消除时间，来自最低CeO₂ NPs处理水平（500 mg/kg）的五条蚯蚓被净化12、48和72 h。净化后，所有样品用去离子水清洗，使用氯仿嵌入组织钛树脂进行麻醉，并使用液体含氮异戊烷进行快速冷冻(-159°C）。然后用切片机和低温恒温器在50mu;m厚处对样品进行轴向切片，并进行冷冻干燥。随后，将样品安装在欧洲同步辐射设施ID21光束线处的4mu;m Ultralene窗口膜之间，用于mu;-XRF/mu;-XANES分析。

mu;-XRF元素图在5.8keV、不同步长（35、3和1mu;m2）和100mu;m²下进行200毫秒的停留时间。焦点是通过固定曲率实现的minus;贝兹镜光学。光子通量为5.7times;1010个光子，波长为5.8kev，光束尺寸为1.0times;0.5mu;m2（Htimes;V）。荧光信号是用一个80 mm²的带Be窗口的SGX硅漂移探测器检测的。使用两个光电二极管测量入射和透射光束强度。在高光谱模式下进行mu;-XRF采集，记录图像中每个像素的XRF光谱。使用PyMCA软件对所有地图进行拟合，以获得元素的强度分布。对于mu;-XANES数据采集，使用Si111单色仪选择能量，并从5700至5850 eV进行扫描。最终的Ce-LIII边缘光谱为3minus;5次单独扫描的总和，积分时间为0.1s，能量步长为0.5ev。使用CeO₂ NPs和Ce^{3 2}（CO₃）₃的mu;-XANES光谱作为参考材料，并以粉末颗粒的形式在透射和荧光模式下进行分析。为了对选定区域中的铈形态进行深入表征，Ferraro等人报告了在荧光映射模式下获取mu;-XANES光谱。简而言之，通过扫描步长为0.7times;0.7mu;m2、每像素停留时间为80 ms、能量步长为0.5 eV（从5700到5760）的光束来记录图像。这导致使用对Ce L3M4和L3M5发射线有选择性的感兴趣区域记录了120幅图像，并针对探测器死区时间进行了校正，针对入射通量的变化进行了校正。使用Elastix将图像堆栈对齐，并保存到hdf5文件中，该文件包含要使用PyMCA进行XANES光谱提取处理的每个贴图的强度和能量值。Athena软件用于背景去除、光谱归一化和线性组合拟合。

2.8 统

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