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从黑加仑及其抗氧化活性的多糖加压水提取优化外文翻译资料

 2023-01-10 04:01  

从黑加仑及其抗氧化活性的多糖加压水提取优化

原文作者 Yaqin Xu, Fei Cai,Zeyuan Yu,Li Zhang,Xingguo Li,Yu Yang,Gaijie Liu

摘要:从黑加仑果实多糖中使用反应曲面分类研究法(RSM)进行加压水提取法(PWE)的研究。PWE的最佳条件为:时间51分钟,压力1.6MPa,温度52℃。在这些条件下,黑加仑多糖实验产量(RNLP)为11.68plusmn;0.12%,与预测值(11.77%)非常吻合。与D4006初步净化后的大孔树脂后,我得到了RNLP及其化学特性通过气相色谱法、高效液相色谱法和红外光谱法的使用。RNLP我是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和摩尔比2.89:14.82:1.02:1.00:2.53:6.39的葡萄糖组成,它的分子量为1.49times;104kDa。我评估了RNLP的抗氧化活性通过自由基清除实验和体外还原力分析。RNLP表现出很强的DPPH自由基和超氧自由基清除活性以及还原力。

关键词: 黑加仑、多糖、加压水提取、反应曲面分类研究法、化学描述、抗氧化活性。

1.引言

黑加仑(Ribes nigrum L.)是一种落叶灌木,原产于北欧和中欧以及亚洲。它也广泛种植在美国北部用于浆果生产。黑加仑富含许多对身体有益的物质,如多糖、不饱和脂肪酸、多种维生素、有机酸、花青素、以及黄酮类(Liu, Kallio, amp; Yang, 2014)。人类食用黑加仑的兴趣增加在于营养和健康的益处,包括抗肿瘤,抗氧化,抗炎,抗凝血以及抗菌作用(Bishayee et al., 2011; Miladinovic acute; et al., 2014)。近年来,黑加仑多糖(RNLP)其有效的免疫和抗肿瘤活性吸引了注意(Takata, Yamamoto, Yanai, Konno, amp; Okubo, 2005)。此外,RNLP已用于化妆品中和用于皮肤的再生以及神经性皮肤炎(Zippel, Deters, Pappai, amp;Hensel, 2009)。最近RNLP被描述为具有抗幽门螺旋杆菌的抗粘附活性(Messing, Niehues,Shevtsova, Boreacute;n, amp; Hensel, 2014)。因此,一个有效技术能够获得大量优质的RNLP,我们需要意识到应用前景。

在一般情况下,植物多糖的提取使用水或水溶性有机溶剂(Chen, Zhang, Jiang, Mu, amp; Miao,2012;Wang et al., 2012)。然而,由于细胞壁由复杂的聚合物组成,采用溶剂萃取法是不容易提取活性多糖的(Wijesinghe amp; Jeon, 2012)。因此,一些辅助的方法也被用来提高萃取工艺,比如微波炉(Zeng, Zhang, Gao, Jia, amp; Chen, 2012),超声波降解法(Prakash Maran, Manikandan, Thirugnanasambandham,Vigna Nivetha, amp; Dinesh, 2013),酶促作用(Zhu et al.,2014),加压水萃取法(Lo, Tsao, Wang,amp; Chang, 2007)等。这些技术的主要优点是减少了提取时间,降低溶剂的体积,以及更高的产量。目前的提取过程中,加压水提取(PWE)似乎是一个相对较新和有前途的技术。PWE是一种环保清洁的提取工艺,这是基于使用的水在温度和压力足够高去维持溶剂的液体状态的提取过程(Beyer amp; Biziuk, 2008)。高温和高压都增加了目标化合物的溶解度和溶剂的扩散率,并降低溶剂的粘度和表面张力,从而更好地渗透到样品基质中(Lou, Janssen, amp; Cramers, 1997)。PWE已经被证实在生物活性物质提取的有用性(Lo et al.,2007; Truong, Hu, Thompson, Yencho, amp; Pecota, 2012; Xynoset al., 2014)。据我们所知,还没有关于RNLP提取使用PWE技术的报告。

反应曲面分类研究法(RSM),作为一种有效的统计工具,可以用来评估各因素之间的相互作用,以及同时估计多个过程变量及其相互作用对响应变量的影响(Prakash Maranet al., 2013)。RSM已成功地应用于改善和优化生物活性物质提取工艺(Chen,Wang, Zhang, amp; Huang, 2012; Ye amp; Jiang, 2011; Zhu et al., 2014)。然而,到目前为止还没有对使用RSM法加压水提取黑加仑多糖优化进行详细的调查。在目前的研究中,RSM法考虑到Box–Behnken设计(BBD)用于PWE来优化操作参数(温度,时间,压力)去获得黑加仑多糖的最大产量。此外,通过采用高效液相色谱法(HPLC),气相色谱法(GC)和红外光谱法(IR)来估计净化后的D4006大孔树脂,我获得了黑加仑多糖的基本特征。另外,RNLP的抗氧化性能即我对自由基清除能力和还原能力通过体外试验进行了评估,例如:DPPH自由基,羟基和超氧自由基清除以及还原能力。

2.材料与方法

2.1.材料

黑加仑果实(Ribes nigrum L., Heifeng)来自哈尔滨(黑龙江,中国)。果实在成熟期采收,然后进行清洗和存放在﹣20℃环境下直到用于进一步的分析。(DPPH), 邻菲咯啉,邻苯三酚,L-( )-抗坏血酸(VC)购自Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA)。其他化学物质的分析等级。所有的水溶液通过aMilli-QWater净化系统的去离子水制备Millipore, MA, USA)。D4006大孔树脂由南开大学(天津, 中国)的一个化工厂制造。

2.2.黑加仑多糖提取

提取过程之前,浆果缓缓的解冻并在一个组织均质机里粉碎(JJ-2,Changzhou Guohua Electric Appliance Co., Ltd., Jiangsu, China)。匀浆的一部分(20克)和去离子水在不同固液比(10:1–50:1(表示为W / W))被置于500ml烧杯,在实验室规模的高压反应器中(WHF-0.25, Weihai Auto-Reactor Co., Ltd., Shandong,China),在不同压力(1.2–2.0 MPa)的不同时间(20–60 min)下,多糖在(40–90 ℃)不同温度下进行提取。提供一份关于PWE提取设备的图片作为补充材料。提取物于3500 rpm离心20分钟,上清液滤过膜聚集(0.45 lm, Millipore, USA)。去离子水稀释滤液决定着多糖的产量。计算多糖产量公式为Y (%) = ctimes;v/wtimes;100%,其中,c是在样品溶液中的多糖浓度(mg/mL),v是样品溶液中的体积(mL),以及w是新样品的质量(mg)。

多糖含量为总糖的含量减去还原糖的含量(Xiao et al., 2009).采用硫酸﹣苯酚和3,5-二硝基水杨酸试验测定总糖和还原糖含量,使用D-葡萄糖做标准(Hu et al., 2005)。热水提取(HWE)为对照实验。该提取方法如下:温度80 C,时间2 h,液固比为30:1 (v/w)(Luo, Ni, amp; Zhou, 2011)。

2.3.单因素试验法

进行一系列单因素试验去测试各个因素对提取的影响以及去识别自变量和适当的BBD范围。通过确定黑加仑多糖的产量评估各因素的影响。

2.4.实验设计

2.4.1.反应曲面分类研究法的加压水提取优化

RSM是用来确定加压水提取黑加仑多糖的最佳工艺条件。单因素试验结果是基于三个处理变量时间,温度和压力的选择上。然后,利用BBD和产量(Y)研究这些关键变量的影响作为设计实验的出发点。独立变量的范围和它们的水平在表1。选定的变量进行变换,根据以下公式:

(1)

xi和Xi是无因次的量,对于第i个具有独立变量的实际值,中心点X0是第i个独立变量的实际值,以及Delta;X是变化值。

响应函数(Y)被划分成线性的,两次的,以及交互式组件:

(2)

其中Y是因变量,beta;0是常数系数,beta;i是线性系数,beta;ii是二次系数,以及beta;ij是两因子相互作用的系数。

实验设计,图形化和统计分析利用设计专家软件(8.0.6 Statease Inc., Min-neapolis, USA)。所有试验均进行了一式三份。

2.4.2.预测模型的验证

三实验使用RSM预测方程,在获得最优条件下进行试验。实验和预测值进行了比较,以确定数学模型的有效性。

2.5.黑加仑多糖的纯化

在最佳条件下的水提取后,黑加仑多糖以80%的最终酒精浓度沉淀和通过冷冻干燥进行水的去除(FDU-1100, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Tokyo, Japan)。D4006大孔吸附树脂用于进行初步纯化黑加仑多糖,柱床体积(BV)和大孔吸附树脂柱的填充长度分别为94.0ml和30cm。操作条件为:处理量0.5BV,料液浓度为4.0mg/ml,以及流量为0.5ml/min;然后柱用1.0ml/min流量的去离子水洗脱以及去离子水的总体积为1.0BV(94ml)。收集的馏分连续浓缩、透析(3500Da)和冻干。这部分被命名为黑加仑多糖I,用于进一步的结构表征及生物活性测定。利用考马斯亮蓝G-250的方法测定该蛋白的含量以及牛血清蛋白作为标准(Lott, Stephan, amp; Pritchard, 1983)。采用D-半乳糖醛酸为标准,根据咔唑硫酸法测定糖醛酸含量(Kintneramp; Buren, 1982)。

2.6.黑加仑多糖I的结构表征

2.6.1.分子量测定

采用高效液相色谱仪器对黑加仑多糖I进行分子量的测定(LC-10A, Shimadzu Corporation, Japanese) equipped with a refractive index detector (RID-10A)。黑加仑多糖I溶于蒸馏水(2 mg/mL),然后通过一个0.45mu;m滤过器和一个10mu;L适用于超水凝胶2000线性柱(7.8mm i.d.times;30cm, Waters, USA)。一个以0.6ml/min流量用蒸馏水的等度洗脱。压力保持在恒定的2.2MPa。用不同分子量的葡聚糖标准对校准曲线进行了校正(Dex-tran T-10, T-40, T-70, T-110, and T-2000)。葡聚糖标准的确定根据上述所描述的方法。

2.6.2.单糖组成测定

利用气相色谱分析单糖的组成(GC-2010, Shimadzu Corporation, Japan)。简单地说,黑加仑多糖I样例(30mg)在120℃条件下的2mol/ml三氟乙酸(TFA)中水解1h。随后,水解产物在40℃减压蒸发干燥,紧次是甲醇洗涤几次直到中和。用于水解乙酰化过程是根据朱某等人进行略微的改变(2014)。10mg盐酸羟胺,7mg肌糖(内部标准)和0.7ml吡啶加入水解液的样品中,然后震荡并在90℃的水浴中加热30分钟。这种混合物被冷却到室温后,加入0.7ml乙酸酐,然后在90℃水浴中加热30分钟完成乙酰化。然后0.4mu;L的衍生物通过0.45mu;m的过滤器,利用火焰电离检测器(FID),使用气相色谱法分析。使用RTX-1701石英毛细管柱,以1.0 mL/min高纯度氮为载气。喷油器的温度保持在280℃。柱温,加热到初始温度180℃,以每分钟5℃的速率加热到220℃,并在220℃保持5分钟。温度又以每分钟10℃的速率增加到了280℃,以及保持这个最终温度20分钟。标准参考单糖包括D-木糖,D-半乳糖,D-甘露糖,D-葡萄糖,D-阿拉伯糖和L-鼠李糖。总之,每一个标准单糖样品10mg根据上述方法分别乙酰化。确定保留时间,每一个乙酰化标准单糖(0.4mu;L)分别采用气相色谱分析。然后每个标准单糖(10mg)混合和混合后单糖乙酰化以及分析,根据相同的程序。

2.6.3.紫外光谱和红外光谱分析

紫外光谱是双光束记录的分光光度计(TU-1901, Beijing Purkinje General Instrument Co., Ltd., Beijing, China)。红外光谱由红外分光光度计获得(FTS135, BID-BAD Company, USA)。样品用溴化钾粉末(KBr)涂在表面以及分析波长范围为4000–400 cm-1

2.7.黑加仑多糖I体外抗氧化活性测定

2.7.1.DPPH自由基清除活性

采用王等提及的上述方法对DPPH自由基清除活性进行了研究(

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