在棕色的棉花纤维里转录组和生物化学的分析显示详细的原花色素生物合成途径

摘要

棕色棉花纤维是主要的未加工的原料在彩色棉花产业里。过去的学习告诉我们棕色色素在棉花纤维属于原花青素。为了澄清细节等量生物合成途径在棕色的棉花纤维里，基因表达剖面图在改进棕色和白色纤维有对照的数字通过PCR技术进行基因表达分析。与本白棉相比，天然彩色棉微尘和杂志含量明显偏高，但成熟度却没有明显差异，苯丙氨酸PA单体的所有步骤（黄烷-3-醇）均显著上调在棕色纤维中。液相色谱-质谱分析表明，棕色纤维最自由的黄烷-3-醇在2-3反式来自（儿茶素），和聚合物PAS主要单位三羟基。与单体成分相一致，黄酮类化合物转录水平39，59-羟化酶和无色花色素还原酶在棉纤维都比它们相互竞争的酶在同一基板上的作用高（分别是二氢黄酮醇还原酶和花青素合成酶），一起采取后，我们的数据揭示了一个详细的生物合成途径，完全激活棕色棉纤维，证明39，59-羟化酶和无色花色素还原酶代表棉纤维生物合成的主要流程。

介绍

天然彩色棉是生态纺织品的重要原料。用天然彩色棉，纺织厂商可以消除染色加工过程，显

著降低加工成本，环境污染和化学残留在织物。此外，天然彩色棉可以有较低的可燃性与传统白棉相比，紫外线防护值较高。不同色调的棕色棉纤维在现代有色棉工业中应用最为广泛。一个丰富的信息已获得有关的化学性质和棉纤维中棕色色素的生物合成途径，这表明这些色素是花青素（PAS）。然而，颜料的化学性质和在棕色棉纤维中的生物合成途径的细节尚待阐明。也被称为PAS，凝聚的是广泛分布在植物鞣，具有各种功能如在种皮和保护剂对草食动物和微生物色素。PA也是影响口感的重要因素，苦味和涩味贡献我们的日常食品和饮料。此外，PA的抗氧化和抗发炎的特性使它成为人类疾病的一个潜在的化学预防药物，包括癌症。花青素低聚物或聚合物的多羟基黄烷-3-醇单元。PA聚合物是通过添加黄烷-3大概是合成的，并能引发的黄烷-3-醇（leucoanthocyanidin）单位或一个黄烷-3-醇链的终端单元的分子（图1）。无论是黄烷-3-醇和黄烷-3，4-二元醇通过植物类黄酮合成途径合成。这条途径的细节不同的组织和物种，并确定在不同的植物中的成分。

在试图澄清棕色棉纤维的生物合成途径的细节，我们进行了数字基因表达（DGE）分析比较在棕色和白色纤维的基因表达谱棕色和白色纤维中的基因表达谱。共有24个基因被鉴定为棕色纤维显著上调。此外，我们确定了PAS在棕色纤维化学性质采用液相色谱-质谱（LC-MS）方法。结果发现，PA的发起单位大多数包括儿茶素和主要推广单位棕色纤维三羟基B环。这些结果表明，在棉纤维的棕色色素沉着的详细的。这可能是一个基本的操控生物合成色素和其他黄酮类化合物棉纤维。

材料与方法

RNA的提取和Solexa测序

一个重组自交系（RIL）群体分析从白色棉品种渝棉1号之间的交叉棕色纤维线号构造描述。总RNA从开花后14天纤维中提取（DPA）使用改良的CTAB法。等量的10个白色和棕色纤维重组自交系总RNA混合形成两个RNA块材（分别是WCF和BCF）。DGE分析RNA块材进行深圳华大基因使用标准程序（深圳，广东，中国）。简而言之，生物素标记的寡聚d（t）的引物来启动合成双链脱氧核糖核酸。经过NlaIII限制，39 -cDNA末端进行磁法和链接到一个适配器含MmeI识别位点。机械电子工业部切连接第二接头后，标签测序的基因组分析仪（Illumina公司，San迭戈，CA）采用Solexa技术。沉积在NIH序列读取档案号srp033354下原始序列数据。序列标签注明的对准棉花基因和Singleton EST差异表达的基因（DEGS）在WCF和BCF块材，根据相应的标签的频率由一个错误发现率（FDR）设置一个截止认定，0.001和一个BCF的频率比WCF高 2或0.5。感兴趣的基因和ESTs的BLAST搜索映射到棉花Phytozome D基因组。

定量RT-PCR

定量RT-PCR采用每10棕色和白色纤维重组自交系群体优势PA合成酶基因表达水平的检测所调查的基因和相应的引物在表1中列出.从棉花的组蛋白3和伸长起始因子5个基因被扩增为核糖核酸标准.PCR是在cfx96tm实时PCR检测系统进行绿色超级混合SYB（Bio-Rad，CA，USA）.热循环参数如下:95uc，2分钟，40次95uc，10和57uc，20 S.一个标准的熔融曲线被添加到监测的特异性的聚合酶链反应产物，这些反应是重复3次，数据使用软件Bio-Rad CFX（经理2厂家）提供的分析。

棉纤维的提取与纯化

如所描述的,从发展中的棕色棉纤维中提取和纯化，约10克从20 DPA铃收获纤维地在液氮细粉提取50毫升80%丙酮水溶液在4uc里两小时。解离心5分钟，上清10转000结合丙酮蒸发真空在35Gamma;C。剩下的两微升等分水溶液进行检测发现dpa-6s墨盒填充聚酰胺（500 mg，西格玛奥德里奇化学公司）。洗涤后用5毫升30%甲醇功率放大器是用2 mL 90% N，N-二甲基甲酰胺。最后，洗脱液，蒸干在真空条件下，在甲醇中重悬，并进行LC-MS分析。

LC-MS分析

检测纯化的PAS黄烷-3-醇单体，LC-MS分析是进行LC-MS系统，一个气温 C18柱（5毫米，2.16150毫米，韦尔奇材料，公司，上海，中国）。溶剂水：甲酸（99∶1，v／v），B和溶剂是乙腈：甲酸（99∶1，v／v）。约5毫克的功率放大器注入，并与溶剂乙的梯度洗脱，以在一个流速为0.2毫升/分钟。90%分钟等度洗脱溶剂10%和溶剂B后，溶剂乙的浓度从10%增加至30%（体积/体积），在12分钟内，随后15分钟的B和3分钟再平衡10% B 100%洗涤。在选定的离子监测模式的正离子进行了监测，黄烷-3-醇单体是根据典型的离子和正宗的标准的保留时间确定，而在3.92和6.62分钟，分别测定没食子儿茶素和表没食子儿茶素与 306 H 离子分别以真实的标准曲线计算出的黄烷-3-醇量。

为了阐明其化学性质，用酸-丁醇法对纯化的聚酰胺酸进行了水解。PAS混合等体积（50毫升）浓盐酸：正丁醇（1:9，V / V）的在1小时的水解产物被蒸发干燥在真空100uc孵育，100毫升甲醇水溶液重悬（15%，v/v），并进行LC-MS分析。柱和溶剂是同样使用检测黄烷-3-醇单体，而梯度分布如下：0到3分钟，溶剂B 10%；3到20分钟，10%到40%的B；20至40分钟100% B；20至23分钟，10重新平衡B %。为典型的离子和飞燕草色素的保留时间，矢车菊和天竺葵（Indofine，hisllsborough，NJ，USA）进行[ 304 H] 14.81分钟，[ 288 ] H 16.73分钟，和[ 272 plusmn;18.33]分，花青素是泉可根据典型的峰面积参照相应的标准曲线。

结果

数字基因表达（DGE）棕色和白色棉纤维分析

纤维中黄酮类化合物和色素积累可能延缓纤维发育和降低最终的纤维品质和产量[9,27,28 ] 。分析色素生物合成的分子基础在纤维发育的影响，在棕色和白色棉纤维基因表达谱（BCF和WCF）是由DGE分析比较。发展中的纤维产生了300万多个标签2，包括860 036 2 913 186清洁标签在BCF和WCF的图书馆。其中，35664（31.26%）在BCF和29048个不同的标签（30.27%）在WCF被明确地映射到一个特定的陆地棉条或Singleton EST（ftp://ftp.ncbi.nih。gov /仓库/条/ GOS sypium棉/ ghi.seq.uniq.gz，2010）。在BCF和WCF的基因表达水平进行比较，根据块材对应的标签频率。差异表达基因共2079个（FDR，0.001）进行了鉴定，其中1165个基因表达上调（表达水平比BCF / WCF。2）和914道量降低（BCF / WCF，0.5）棕色纤维。

基因本体论（去）分析表明，车辆的细胞成分（包括膜有界囊泡和胞囊泡）和膜是最显着的在差异表达基因（DEGS）为代表的白色和棕色纤维之间（表2）。最显着代表京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路在DEGS进行氧化磷酸化和泛素介导的蛋白水解作用（表3）。此外，一些基因是参与纤维发展调控有关的生理过程，如活性氧[ 29 ]和乙烯[ 30 ]（表4）。这些数据表明，棕色纤维基因（LC1）和/或色素积累的棉纤维会影响纤维的发展等多方面铒比纤维着色。

白色和棕色纤维中尼龙合成酶基因的表达

在高等植物中，PAS合成通过苯丙氨酸类黄酮途径的黄烷-3-醇（图1）[ 10,11,14,15 ]。以棕色和白色棉纤维DGE分析，总共34个PA合成具有基因（表5）。在这些基因中，有24个显着上调，棕色纤维，但没有显着下调。这些上调基因编码3苯丙氨酸氨酶（PAL）、2肉桂酸羟化酶（C4H）、1，4-香豆酸：辅酶A连接酶（4CL），6查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）1，2黄3-hydroxylases（F3H），2类39，59氢化可的松该例（f3959h），2个二4-还原酶（DFR）、2无色花色素还原过程（LAR），1花青素合成酶（ANS）和2花青素还原酶（ANR）。因此，每一步从PAL ANR在PA生物合成途径（图1），至少有一个基因表达明显上调的棕色纤维（表5）。

为了验证DGE分析结果，表达水平的主要PA合成酶基因对苯丙氨酸的黄烷-3-醇的所有步骤（图1，表1和5）和黄酮39 HY（f39h羟化酶基因同源，gorai.008g198200 G. raimondii）是棕色和白色的纤维通过实时荧光定量PCR检测。与白纤维相比，所有12个基因的表达上调棕色纤维（16260倍，图3a）。此外，磷酸合成酶基因的高水平表达与个人共系棕色纤维分离，例如LAR和f3959h基因（见图E 3B）。这些结果与DGE剖面和证实，棕色纤维基因一致（LC1）完全激活PA生物合成途径在棉纤维。DGE分析也显示，不同的黄酮合成酶的转录水平在棉纤维中存在显著差异（表5和图4）。在白色的纤维，在常见的步骤相关合成酶黄酮类化合物的生物合成（PAL、C4H、4CL、CHS、F3H和卡，f3959h）和PA的具体步骤（LAR和ANR）呈中度表达水平（20200 TPM），而DFR和ANS有非常低的表达（2，TPM）。棕色纤维，不同PA合成酶相关转录模式类似于白色纤维（图4）。虽然全纤维的途径是显着上调，棕色纤维，DFR和ANS有中度（55.26 TPM）和低（7.34 TPM）的表达水平，分别在其他PA合成酶的表达水平更高的比较（如940.2和616.43 f3959h TPM TPMLAR）。这些数据表明，不同的黄酮合成酶基因在棉花纤维的相对表达谱是严格受转录水平调节。棕色棉纤维转录分析中单体的单体组成，揭示了一种完全活化的棕色棉纤维的生物合成途径。为了进一步澄清这一途径的细节，E采用LC-MS法测定PAS在棕色纤维单体组成。四黄烷-3ols（没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素）被确定在PAS棕色LC-MS分析纤维，与摩尔百分比3.060%.2 85%.461%.4% 10.861.2 0.860.1（图5A，分别–C）。在这些单体，2，3-反式-黄烷-3-ols（没食子儿茶素、儿茶素）占96.2%，这表明大部分免费的黄烷-3-醇然后发起单位的棕色棉纤维聚合物PAS通过LAR分支合成的，而不是和/或在酸水解的花青素成分反映相应的PAS [ 26 ]扩展单元组成。要确定的组成的尼龙纤维延伸单位，我们检测到的酸性正丁醇反应释放花青素。如图5–G所示，三种花青素（天竺葵色素、矢车菊素、飞燕草素）与9.460.7 %摩尔分率检测，12.861.4 77.861.8 %和%，分别。高比例的飞燕草色素PA酸水解物表明，棕色棉纤维的主要PA推广单位favan-3-ols trihydroxy1ated B环。因此，发起和推广单位对棕色棉纤维主要由黄烷-3-醇trihydroxy1ated B环，表明f3959h对PA生物合成的主要作用棕色棉纤维。综上所述，转录组学和生化分析集体详细演示了PA的生物合成途径全面上调，棕色棉纤维，其中f3959h和LAR代表PA生物合成的主要流程。

讨论

颜料的化学性质是天然彩棉开发的重要线索。早期提取实验表明，天然彩色棉中的色素属黄酮类化合物[ 1 ]。花等人在棕色棉纤维上显示了许多高的活性，与白纤维相比[ 9 ]。表达分析表明，多种黄酮合成酶基因，如赤、F3H、DFR、ANS、ANR，C4H，CHS，f39h和f3959h，显著上调，棕色纤维[6,8]。近日，李和他的同事发现了15类相关蛋白（包括PAL、CHS、F3H、DFR和ANR）与棕色棉纤维经高丰度的比较蛋白质组学分析的BCF和WCF的N耳等基因系[ 5 ]此外，PAS和棕色纤维PA前体的浓度比在白色纤维[5,6,8,27 ] 高多了。这些研究一致表明，棕色纤维中的颜料属于给。在本研究中，我们的目的是解剖的细节，在棕色棉纤维的生物合成途径。DGE和qrtPCR的分析，我们发现，所有研究的PA合成酶（包括PAL、C4H，4CL，CHS，chi，F3H，f39h，f3959h、DFR、ANS、ANR和LAR）均显著上调，棕色纤维，表明棕色纤维基因（LC1）激活整个PA生物合成途径在科特纤维。此外，生化分析表明，主要的PA单元三羟基B环最自由的黄烷-3-醇为2，3-trans形式。这些结果表明，f3959h和L以氩为代表的棕色棉纤维的生物合成的主

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