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为设计合理的稳定P53的药物：探索致癌性的Y220C突变体表面

Nicolas Basse,1,2 Joel L. Kaar,1,2 Giovanni Settanni,1 Andreas C. Joerger,1 Trevor J. Rutherford,1 and Alan R. Fersht1,*

1Medical Research Council Centre for Protein Engineering, Cambridge, CB2 0QH, UK

2These authors contributed equally to this work

摘 要

P53癌症突变体Y220C诱导蛋白质表面形成能够容纳稳定化小分子的腔体。我们结合片段筛选和分子动力学来评估p53-Y220C的成药性还要绘制突变腔体内部与配体相互作用的位点。通过晶体照相术产生一张药物如何进入腔体的清晰图像来阐明片段击打的结合模型。模拟实验用异丙醇溶解蛋白发现了额外的位点使成药表面得到扩展。此外，通过结构的观察和模拟得到腔体的动态图像，促进了我们对p53的突变对其稳定性的影响的理解。这些也加强了了在筛选最佳配体时考虑腔体适应性的意义。我们的发现为设计能够治疗p53-Y220C癌症的有效药物提供了蓝图。

简 介

抑癌基因p53是细胞反应对致癌压力的一个基本的调节子，抑癌基因p53的突变是人类癌症中最常见的遗传变异。大约30%的使p53失活的突变是仅仅降低核DNA与p53结合区域的解链温度，这样就能使其在细胞中快速地失活。理论上，这种解链温度引起的突变，此后的活性可以通过分子有选择性的结合到其非变性结构上而不是变性区域来修复。细胞内的功能研究表明p53基因的温度敏感型突变在低温下是活性可逆的，有证据显示这种突变的活性在生物学背景下能够被修复。

用小分子再活化p53基因的原则是：首先已证明了用一个小肽，CBD3（带3蛋白胞浆区），这段肽能够可逆的结合到与p53结合的DNA区段。在体外这段肽引导到稳定的p53野生型和p53突变体上，提高癌细胞系中p53突变体的活性。另外还有许多其他的分子被报道能够在细胞内修复p53突变体的活性。然而，这些分子是怎样恢复p53的活性的或者至于那些不结合到野生型或突变型p53的分子诱导p53类似物，效果仍不明确。最近已经提出了一个可供选择的分子组（即，PRIMA-1和MIRA-1）或它们各自的水解产物可以共价地通过修饰半胱氨酸残基与p53反应，这提供了一个可能的机制用于在细胞中靶向p53（Lambert等人，2009年）。这是似乎合理的结合到p53的半胱氨酸残基的分子也可通过蛋白的氧化还原状态的调节调节p53活性。考虑到向着发展新的抗癌药的分支发展，有一个基本的要求-发现能够直接使温度敏感型p53突变稳定的小分子。

突变体Y220C，p53基因中一种普遍的致癌突变体（与每年约75000个新的癌症案例相联系；Joerger and Fersht,2008;Petitjean et al.,2007）目前一种最普遍的想法模型：寻找和研究一种小分子能够用一种特定的突变方法来稳定p53基因。酪氨酸突变成一个半胱氨酸显著的降低了蛋白质的热力学稳定性还在蛋白质表面的突变位点明显的诱导形成了一个潜在的成药性腔体，这个位点远离蛋白质表面的功能区域，否者将扰动蛋白的总体结构（Joerger et al.,2006）。因此一个小分子被标记导可突变腔体并假设能够结合上去，当稳定蛋白质的时候，这并不会影响到p53基因的功能。进一步说，这种小分子不会结合到非癌性细胞中的正常的p53基因。

我们最近报道了PhiKan083的发现，用一种简单的电脑模拟对接算法发现的一种可结合到变异p53-Y220C腔体的咔唑衍生物。这种分子能够通过稳定的亲和力结合也能够提升解链温度使p53-Y220C的变异速率慢下来，他是第一个如此特异引导突变p53基因的药物。这种作用的显著的结果是在计算机模拟预测中在蛋白质中一个小的诱导契合动作有很大的影响，能够影响到产生的自然结果。这个发现巩固了补充搜索能够结合到p53-Y220C的分子和考察其结合位点的成药性的原理的必要性。

这里，我们描述片段扫描和分子热力学模拟去进一步探索p53基因的Y220C突变体的成药性表面的用途。特别的，我们努力去确认突变腔体表面的全部配合基相互作用位点，这个也能为我们设计能够通过类药关系结合到p53-Y220C的小分子提供蓝图。我们也寻找新颖的引导支架通过独特的结合模式来拓宽我们目前的关于药物怎样进入腔体的图像。同时，配合基结合热点和新颖支架的鉴别是呈现最佳的PhiKan083的必要基础也是药物设计的可供选择的起点。

基于片段的支架筛选已经作为一种评定蛋白成药性和确认位点和支架相互作用的强有力的工具（Bembenek et al.,2009;Ciulli and Abell,2007;Hajduk and Greer,2007;Hajduk et al.,2005b）。这种技术限定了使用分子的低的分子量和探针的化学复杂性能极大地有利于支架黏合。片段分子和一个蛋白相互作用的倾向指示着一个蛋白是否能够容纳一个具有类药性的分子（Hajduk et al.,2005a）。相似的，计算的和实验的原理都表明用有机试剂作为探针能够被用于在蛋白上的支架黏合位点。（Dennis et al.,2002;Liepinsh and otting,1997;Seco et al.,2009）

在这个工作中，我们已经waterLOGSY（基于辐射阻尼(Radiation Damping, RD)的生物大分子的配体筛选技术RD-WaterLOGSY:WaterLOGSY是目前最常用NMR配体筛选技术之一。该技术通过对水的磁化矢量的选择性激发,进而依靠水、蛋白、配体三者之间的化学交换和NOE效应将水的磁化矢量传递到配体小分子,实现与生物大分子有相互作用的配体小分子的快速选择性检测。）技术和热变性扫描荧光测定法筛选了针对p53-Y220C片段文库的核心区域。通过异核单量子相干（15N/1H HSQC)）核磁共振实验证实了片段结合。数种片段的结合模型通过X射线晶体学被解决。此外，分子动态模拟已经被用于探测突变腔体的动态特性和异丙醇的选择结合模型，分子动态模拟能够模仿一个小分子药物。

结果和讨论

片段扫描

在T-p53C-Y220C上的结合位点，是一个Y220C突变体的稳定的p53的核心区域，最初是通过针对化学多样性片段文库进行筛选探讨的。近1900个分子的文库是根据片段的三个广义的理化性质设计的。为了最大限度地减少假阳性和假阴性的结果（即结合到T-p53C-Y220C但没有被检测到的片段），两个平行的方法被用于筛选，其中包括waterLOGSY一种一维配体观察的NMR法，和热变形荧光扫描这种方法是扫描外源性荧光染料蛋白配体在Tm上的作用。

通过waterLOGSY和热变性荧光扫描筛选发现分别有205个和47个片段撞击到T-p53C-Y220C（表1）。通过热荧光变性扫描识别的撞击次数中Tm被观测到变化最大的数值是1.8plusmn;0.2℃结合两种方法观测到的撞击次数通过15N/1H HSQC被证实，这是一种被普遍认为的最具权威的检测蛋白-配体结合的相互作用的方法。waterLOGSY和荧光热变性扫描的最终命中率，在仅考虑那些被证明能够结合的片段的情况下分别是3.7%和0.9%。命中率的比较表明荧光热变性扫描法错过了大量片段的命中。一个可能的假阴性的原因是在测定中荧光分子的荧光猝灭导致的。另外，对命中率的分析提供了T-p53C-Y220C的成药性的预计。合并的命中率只比那些已被开发利用的高亲和力的蛋白质配体的阈值略低。分析最终匹配的碎片这些碎片为总数的84%，发现一些它们有一定的结构相似。这些相似性组成的药效特征能够被用于将匹配的碎片分类。这些碎片可以被分为7个独特的家族，就像图1所示。在关键药效团特征之中每个家族之间的区别在于中央支架区域的环的数量，当中央区域不止一个环时，环与环之间的距离也有区别，还有具有芳香性的环系统，环的分子数量以及取代基的大小等都影响着家族之间的区别。分子14被发现与被确认的匹配物有很强的亲和力（Kd=105plusmn;mM）。尽管很难预测蛋白质与片段之间的特殊的结构特征对其相互作用形成的影响，但是非常有可能是，各片段模拟的环系统中的突变酪氨酸侧链，在疏水基之间形成填充物连接到腔体。

表1.WaterLOGSY和热变性扫描荧光法对T-p53C-Y220C的片段筛选结果

热变性扫描荧光测定法是一种相对较新的用于片段筛选的生物物理技术。尽管人们对这种筛查技术的兴趣越来越高，但是很少有测量弱亲和力的实用的数据，而这恰恰是片段的特征。据我们所知，这篇报道是第一次直接比较热变性扫描荧光测定法和核磁共振法，核磁共振是用于片段筛选的能够广泛第分析配体亲和力的一张传统工具。在被确认的匹配物中，17个来自热变性扫描荧光测定法，waterLOGSY发现了70个。有趣的是，只有三个片段是同时被两种方法检测到的，说明两种测定方法的重叠性很低。这些片段不共享任何明显的结构相似性，这种结论能够用来描述为什么他们不被两种检测方法同时检测出来，或者更重要的是描述在两种检测方法中为什么没有发现绑定的片段。尽管热变性扫描荧光不如waterLOGSY的灵敏度（即更高的假阴性率），这筛查结果清楚地表明它仍然产独特的匹配物还有它也可以被用于作为补充的片段筛选技术。

图1.被确认的片段匹配物的药效团分类

这些匹配的片段在其化学结构的基础上被分类。每一类根据其典型的结构被分离列出。被X光散射技术解决了结合到T-p53C-Y220C的模型的匹配片段的编号用加粗和下划线标注出来。

寻找匹配片段的目标结合位点

通过15N/1H HSQC提供的位点特异的蛋白质的结合表面的分离度来分析配体的结合。目标结合位点能够通过残余物的共振映射的化学位移也就是绑定物的扰动来确定。因为T-p53C-Y220C是非常不稳定的蛋白质，只有通过与野生型p53类推，例如峰重叠在一起和突变蛋白质的有限的三重峰核磁数据，才能得到其局部的共振排布。不幸的是，接近于突变位点的共振态和野生型光谱有明显的区别，而且这是是最难用明确地要求去区分的。

对T-p53C-Y220C与匹配片段的复合物的15N/1H HSQC光谱的化学位移的分析发现.多重峰的干扰（图2）。被定位于腔体核心区域的Val147和Asp148残留物，就在这些互相干扰的被确认的匹配片段之间。在许多匹配片段的光谱中，残留物Tyr107,Thr155和Ser260，这些残留物都是位于腔体内，都出现了位移。残留物的干扰加上观察到腔体外的残留物不受绑定物的影响，这意味着片段能够专一性地结合到腔体区域。许多在峰上的显著的位移没有对应物 ，但是它们被认为是腔体内的残基，这进一步证明了片段结合到突变位点这一结论。因为蛋白质上的其他位点没有干扰，这能进一步的推测野生型的p53是一个非常有挑战性的目标，这与结构观察结果相符合，结构观察结果表明野生型缺少明显的表面裂缝也就是只有突表面特性改变了的变型的p53才能做药物标靶的候选。与此一致的是，用waterLOGSY和热变性扫描荧光对野生型p53的核心区域进行筛选没有发现任何匹配的片段。此外，在光谱间的一些少量的共振峰之间的化学位移有明显的差异，这表示片段也许是通过不同的结合模型结合的。然而，在绑定的囊中分子的精确定位和总体取向都不能仅仅通过15N/1H HSQC来确定，而是还需要使用结构测定方法。

图2.T-p53C-Y220C覆盖物的15N/1H HSQC光谱

T-p53C-Y220C（红），结合到T-p53C-Y220C的片段2（1mM,蓝），3（1mM，蓝绿），4（1mM，橘黄），11（1mM，绿）和15（1mM,紫）。在突变腔体里或靠近腔体的残基Val147, Asp148, Tyr107, Thr155, 和Ser260的共振态都被标注出来了。下面的图是Val147和Asp148残基上绑定片段后图谱改变的放大图。

片段结合模型的结构测定

为了阐明说有匹配片段的结合模型，将T-p53C-Y220C晶体浸入单一片段中来构建配体复合物，再用X射线晶体法测定。由于腔体内低的片段占有率和结合片段晶囊的破坏，可能只能对被证明的匹配片段的一个小的集合进行对结合模型的结构阐明。解决复杂结构的分辨率的范围在16-21nm之间。片段15的电子密度云图如图S1。在所有的结构中，这小分子只占有一到两个分子的不对称单位，这与我们早期的数据相符。片段2,11,和15的通常的结合模型包含了环系统的夹心法，Pro151和Val147在腔体的一边Pro222和Pro223在另一边。作为结合的一种结果，位于腔体底部的突变的Cys220残基的硫氢基团被取代，因此这囊被加深2A，反过来，使配体能够进入。在蛋白质内部半胱氨酸侧链的翻转引起两条疏水侧链（Val157和Ile232）的协同运动。此外，在腔体边缘的一些残基的转移（如Thr150和Pro222）被观察到在结合物上，这也说明了腔体的灵活性。片段15结合到T-p53C-Y220C的结构显示这分子深深的位于突变引诱形成的腔体内（图3A）。噻唑环上的硫原子被定位在缝隙的最深处的突变Cys220残基附近。除了疏水基团的相互作用，片段15和蛋白质和水分子形成特殊的氢键。最显著的，噻唑环2号位上的胺基和Leu145上的羰基氧形成氢键，Asp228主链上的蓄水分子也通过氢键和胺基相连。因此，它占据了无配体结构的水分子的位置。噻唑二氧己环上的氮和氧也都包含与水形成的氢键。

片段11也包含芳香族的苯并噻唑环系统，片段11在腔体内的结合位置和片段15一样，但是却更加垂直（图3B）。噻唑氮在Thr

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