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铁纳米粒子诱导激活质膜上的H（ ） -ATP酶促进拟南芥液泡的张开

Jae-Hwan Kim,Youngjun Oh,Hakwon Yoon,Inhwan Hwang,and Yoon-Seok Chang

摘要:人工纳米材料能控制和探索微观系统内分子间的相互作用,但是它们不可避免产生的残留物对环境产生的潜在影响在很大程度上仍然是未知的。人工纳米材料对裸露植物产生的影响,比如增加生物量和叶绿素, 有别于那些照射诱导他们的大部分同行，但很少有研究依据这种生理的结果解决机制问题。当前的调查发现，用纳米零价铁处理的拟南芥，能够诱导激活质膜 H -Atp 酶活性增高。活性的增加会引起非原质体 ph 值的降低，叶面积增加，以及气孔孔径增大。基因表达分析表明，H -Atp 酶异构体的水平负责气孔开放，用纳米零价铁处理的植物相比未用纳米零价铁处理的参照植物的植物，AHA2，升高了5 倍。这是第一个研究表明，用纳米零价铁处理的植物，会诱导活化质膜 H -Atp 酶，增大气孔开放程度，导致CO2 吸收量增加的可能。

简介

目前使用的人工纳米材料 (ENMs) 品种在工业领域一般都可以划分为四个类别，如下: （i） 碳基材料，（ii） 金属基材料、(iii) 树枝状聚合物 ，(iv) 微米复合材料-纳米粒子。在市场中，已经可以利用的大量包含人工纳米材料的产品，包括催化剂、 电子产品、 个人护理产品和医疗设备。人工纳米材料在商业产品中的应用预计将逐步推进和直接或间接影响我们的生活方式;然而，它们是否对生态系统的组成部分有毒性影响的未知，是否增加产量，以及商业可用的人工纳米材料的广泛使用引起了环境的关注。人工纳米材料如银纳米颗粒会减少人的肺细胞中ATP的含量，Mn3O4 纳米颗粒能够在同一种细胞类型中增加活性氧方面的产品。

然而很大程度上，人工纳米材料对生物体的毒性仍然是不确定的。在研究金属基人工纳米材料，Fe3O4纳米粒子在中性 ph 值下，对人脑胶质瘤细胞和解毒过氧化氢成水和氧气方面，有pH 依赖的过氧化氢酶或过氧化物酶类似物的影响。

人工纳米材料的研究

研究金属基人工纳米材料对植物特异性的影响是模棱两可的,这需要解决。Ag纳米颗粒抑制发芽的大麦(大麦),而Fe3O4减缓拟南芥根的伸长(拟南芥)。与之相反，Fe3O4 纳米颗粒增多大豆叶片叶绿素的含量，以及低剂量 (0.01minus;0.05 mg/L) 的银纳米粒子促进大豆的生长。

独特性能的纳米粒子，其中包括它们反应性和尺寸大小，在环境修复领域产生了显著的进步。纳米零价铁是高度商业化的地下水修复试剂。最近，植物经纳米零价铁处理造成的生理变化的调查在环境研究方面已经成为重要的议题。我们先前的实验表明它通过生成OH基提高拟南芥根的伸长，导致细胞壁中多糖的降解。这是第一项描述纳米零价铁处理植物根部诱导根长度增加机制的研究。然而，因为补救措施的规模崛起促使增加纳米零价铁生产，所以以后纳米零价铁对植物影响的详细信息是必需的。

植物通过激活产生影响的作用着对各种外界刺激发生反应到他们的环境;因此，纳米零价铁被释放到植物的根际可以说是一种外部的刺激。尤其是，纳米零价铁的强氧化能力通过产生-OH改变ph 值，因而导致根际土壤中铁离子的溶解度降低。此外，因为零价氧化铁的表面由几种氧化铁、氢氧化铁组成，植物在缺铁离子还原酶或缺任何酸性连接物下直接利用粒子是比较困难的。可以在铁利用率低的条件下生长的植物中经常观察到，植物激活细胞膜 (PM) H -Atp 酶来释放质子，酸化其根际土壤，从而，增加PM H -atp 酶的活性。施密特发现不同的PM H -Atp 酶异构体，拟南芥H -Atp 酶 2 (AHA2) 是铁响应根际酸化的主要基因。

都知道通过激活的 PM H -Atp酶可以调节在叶子上气孔开放,最近在通过调节光诱导气孔开放研究知名组件(包括蓝色光受体,质膜 H -Atp酶和Kin 通道)对植物的影响，表明了AHA2成为气孔开放相关的主要基因的过程。

值得注意的是，AHA2，PM H -Atp 酶活性异构体基因负责根际酸化，可以作为一种的鉴定气孔开闭的重要组成部分。我们因此假设根际土壤中存在的零价氧化铁会提高植物PM H - atp酶活性，从而提高了气孔的开放程度。尽我们所知，没有一项研究有一起处理这两种这些现象或考虑人工纳米材料激活H -Atp酶的影响。

我们按顺序测定根系非原质体的ph值和芽中PM H -Atp的酶活性。此外，因为在植物中，气孔是吸收 CO2 进行光合作用的主要器官，了解零价纳米氧化铁激活PM H - atp酶如何介导气孔开放，开发绿色技术来消除大气中的 CO2是有用处的。

材料和方法

实验设计的纳米材料。在这项研究中，商业的RNIP-10DS(户田拓夫、日本)作为零价纳米氧化铁的代表，通过X′Celerator探测器用x射线衍射(XRD)模式被记录PANalytical X′Pert衍射仪(铜Kalpha;辐射)，以及通过使用jeol - 2100高分辨率TEM(HR-TEM)与Cs在200千伏校正获取透射电子显微镜（TEM)的图像。表面面积由利用Mirae SI nanoPorosity XG分析器的N2吸附法测量，

在零价纳米氧化铁中，粒子的平均尺寸和内容Fe0(alpha;-Fe)nZVI通过用谢乐公式和半峰全宽(应用)(fwhm = 0.28°,2theta; = 44.6°)和气相色谱法热导检测器 (GC-TCD)分别来计算。

植物生长条件，零价纳米氧化铁的准备，颗粒用 99%的乙醇和脱气的去离子的水洗涤和漂洗。

1. 水培 半强度的标准,需要Murashige and Skoog medium (1/2 MS培养基;DuchefaBiochemie)，添加剂的浓度，蔗糖 (Duchefa Bichemie)、 MES (aMResco)、 琼脂分别为 20、 0.05 和 0.9%。用70%乙醇和 20%次氯酸溶液消毒制得拟南芥（哥伦比亚生态型） 种子和剩下过程在后续工作更详细地做了介绍。使用的 零价纳米氧化铁的浓度为0.1 g/L.生长室条件是 16 小时/8 小时光照/黑暗和 22 ° C，30%的相对湿度。用 1 /2 MS 培养基培养拟南芥，测定植物叶面积和非原质体ph 值，利用植物在培养基中生长,测定非原质体的pH值、叶面积和AHA2的表达。

2、土培。将高压灭菌处理过的土壤和零价纳米氧化铁悬浮液互相混合制成零价纳米氧化铁混合土壤 ,零价纳米氧化铁在土壤中的最终的浓度是0.5克/公斤。拟南芥种植在土壤里，并放在16 h / 8 h光明/黑暗、20minus;22°C的温室。nZVI混合土壤的初始含水量的60minus;70%。利用将植物生长在土壤中，其余部分进行以下实验研究：PM H - atp酶活性、气孔孔径、水损失。测定根部非原质体的pH值，将处理了10天的种子，浸在0.005%的没有琼脂的1/2 MS培养基溶液的溴甲酚紫(Sigma-aldrich)酸碱指示剂中为期2天，用来对照的指示剂的初始 ph ，幼苗分别在pH值5.8和pH值6.0下用零价纳米氧化铁处理,含有相同浓度的能够反映同等条件下根际的实际情况的零价纳米氧化铁(0.1 g / L)来处理幼苗。气孔孔径测量。生长土壤中三周的幼苗的气孔孔径测定的结果和Hwang做了一些调整后一样。对于这个试验,由于这种测定方法的目的是用零价纳米氧化铁处理时，当前气孔的孔径大小的比较，K 等缓冲液能够刺激气孔开放根本不会有用。表皮细胞制成片子，气孔孔径可以用显微镜(蔡司Axioplan)测量。使用Excel程序(微软)进行统计分析。等离子体膜的制备。三周龄的幼苗植物被用来分离原生质体做前期研究。原生质体在 500rpm下是离心4 分钟，然后再在5 毫升缓冲液（0.25 M 蔗糖，1EDmMTA ，20 mM Tris-HCl，ph 值 7.8）中悬浮。原生质体用两层11mu;m孔隙尼龙过滤器(微孔)轻轻地匀浆过滤三次。提取物在1000 g离心10分钟去除叶绿体和核膜。上清液在6毫升30%Percoll的裂解缓冲的中分层，用有SW41Ti转子的贝克曼离心器在28 000 rpm下离心分离30分钟。质膜部分在离心器管成环状可见也是可以被收集的。利用反应缓冲液 (30 mM imidazole-HCl pH 7.4,130 mM NaCl, 20 mM KCl, 4 mM MgCl2) 稀释Percoll达到去除的目的。接下来，30 000 rpm超速离心2 h，最后,通过10 kDa的微孔获取150ul上层清液，测定PM H atp酶活性。在23°C，利用10minus;20mu;g的质膜蛋白质测定PM H atp酶活性10分钟。为了揭示PM H atp酶失去活性 ，利用0.05%玻雷吉58(sigma;)来选择外囊泡。利用反应缓冲液 (30 mM pH 7.4, 咪唑盐酸4 mM MgCl2,2mM 原钒酸钠,0.05%玻雷吉58)来消除背景信号的atp酶活性。在黑暗中,1毫升质膜碎片与反应缓冲液A,B的混合物冰上孵化1 h。4 mMTris-ATP孵化冰上1 h。添加4毫米是这种测定方法开始的提示。23°C孵化10分钟后，用100 mu;L 的20% SDS终止反应。为了让颜色作为酶活性的观测点，500 mu;L 的反应混合物添加500mu;L的试剂A中，试剂A由3%抗坏血酸、盐酸0.5 N和0.5%钼酸铵在冰上孵化10分钟得到。37 °C培养10分钟后加入的试剂B 500 mu; L （2%亚砷酸钠，2%柠檬酸钠，2%的醋酸）到500 mu; L 的反应混合物中，在850 nm 波长下进行活性检测 。

用共焦显微镜分析内吞作用。我们对前面的Kim等人方法做了一点修改。从两组中,获取两周株龄幼苗的和全部的叶子,不仅表皮,都浸没在1mu;M的FM 4-64溶液(表达载体)10分钟。分别在543 nm和560minus;615 nm波长下获取荧光图像(蔡司Axioplan)。

实时定量 PCR (qRT-PCR)。用RNeasy植物试剂盒分别从2 周龄植物的根和叶中分离总RNA。用cDNA逆转录生物系统完成cDNA的转化。通过SYBR绿色装备检测放大探测器进行实时定量PCR。肌动蛋白2被用来作为内生控制。10 ng的cDNA互补物在20mu;L反应液和0.5 mu;M 引物以及一个单位的Taq聚合酶中进行PCR扩增。肌动蛋白2的引物序列是F 5′TGACTGATCTTCGATCCTCTC 3′,R5′GAGAATG TGCATGTGCCAAAA 3′ for AHA2, F 5′ TATGAATTACCCGATGGGCAAG 3′,R5′ TGGAACAAGACTTCTGGGCAT 3′。放大条件一样在94°C:变性4分钟，紧随其后的是在94°C 15s,55°C 30s,60s和72°C，扩增30个周期。

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■结果与讨论

纳米零价铁的表征。用的零价纳米氧化铁粒子的化学物理属性，如图1所示，包括透射电子显微镜(TEM)图像,x射线衍射(XRD)模式，表面积、颗粒大小和Fe0含量百分比(wt %)。XRD模式(图1A)表明，典型Fe0的三个高峰出现在44.6,66.0,和82.3°的结晶时。如图1B所示,零价纳米氧化铁粒子的TEM图像,单粒子尺寸似乎不足100 nm，但由于粒子磁相互作用等化学特性发生聚集。表面积是30plusmn;2平方米/ g,平均颗粒大小54plusmn;1纳米(图1 c)(使用谢勒的公式计算)。Fe0在nZVI中的百分含量与早期分析相比有略高的价值。

图1所示:在这项研究中利用的是零价纳米铁粒子的物化性质

(A)x射线衍射(XRD)模式;(B)透射电子显微镜(TEM)图象;(C)粒子的表面积、尺寸大小和(alpha;-Fe)的含量百分比。

(a)粒子大小用谢乐公式计算(2theta;= 44.6°)。(b)在浓盐酸中用GC-TCD H2测量。nZVI增加质膜H atp酶活性。两组10天大的幼苗, 一组用nZVI处理，另一个未经处理的作为对照组,在孵化过程中用溴甲酚紫(0.005%)处理2day后，测量非原质体的pH。溶剂的密度可以通过紫外分光光度法来测定(图2)。

拟南芥的负面价值被体现，当幼苗经nZVI处理，非原质体的pH值比对照的5.8酸性更强时，对照组幼苗的非原质体pH值在整个实验中几乎保持不变；因此经nZVI处理后，非原质体的pH值会降低。这个根质外体的酸化与PM H -ATPase活性的增加有关。通过释放质子到根部，atp酶在运输质子方面起着重要的作用。从而植物就可以酸化根际当很少的金属离子如铁溶解时。

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