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设计多肽与羟基磷灰石相互作用研究毕业论文

 2021-03-28 11:03  

摘 要

羟基磷灰石是人体骨和牙里普遍存在的矿物,羟基磷灰石和人体具有良好的生物相容性,研究羟基磷灰石的生物矿化有非常重要的意义。本课题通过查阅大量的资料设计了序列为8个连续谷氨酸的小肽EEEEEEEE与羟基磷灰石反应,从分子层面了解羟基磷灰石的矿化机制。采用傅立叶变换红外衰减全反射光谱法对设计的小肽EEEEEEEE与羟基磷灰石的相互作用进行了表征。研究显示本文设计的小肽EEEEEEEE在溶液中呈α-螺旋,但此α-螺旋极不稳定。在加入羟基磷灰石与其相互作用的过程中,小肽由α-螺旋转变为β-折叠和少量无规卷曲,β-折叠可以促进羟基磷灰石的平行排列和定向生长。钙离子在该过程中起着重要的作用,它快速的与小肽的碳基氧以及羧基阴离子发生作用,诱导该小肽二级结构由不稳定的α-螺旋转变为β-折叠,少部分β-折叠进一步变为β转角;随着这一构象的变化,更多参与氢键交联的肽键被释放出来,带动更多的氢参与与HA的吸附作用,从而促进HA的矿化。

关键词:羟基磷灰石;多肽;二级结构;生物矿化;FTIR-ATR;

Abstact Hydroxyapatite is a common mineral of human bone and teeth. Hydroxyapatite is biocompatible in human body It is very important to study the bio-mineralization of hydroxyapatite. In the study, the peptide EEEEEEEE with 8 consecutive glutamate was designed and synthesized reference to a large amount of date, to study the mineralization mechanism of hydroxyapatite in the molecular level. The interaction between EEEEEEE and hydroxyapatite was characterized by Fourier transform infrared spectroscopy. It is discovered that the peptide EEEEEEEE designed in this paper is α-helix in solution, but this α-helix is unstable. In the process of interacting with hydroxyapatite, the conformation of the peptide is transformed from α-helix to β-sheet and a small amount of random coil, which promotes the parallel arrangement and directional growth of hydroxyapatite. Calcium ions play an important role in the process, which reacts quickly with the carbonyl oxygen and carboxyl anions of the peptide, inducing the secondary structure of the peptide to be transformed from unstable alpha-helix to beta-folded. The β-sheet is further transformed into a beta angle. With this conformational change, more peptide bonds involved in hydrogen bonding are released and more hydrogen bonds were involved in the adsorption of HA, thereby promoting the mineralization of HA.

Key words:Hydroxyapatite; Peptides; Secondary structure;Biological mineralization; FTIR-ATR;

目 录

第1章 绪论 1

1.1 生物矿化概述 1

1.2 有机基质与形核生长 2

1.3 生物矿物的特点 3

1.4 非结构蛋白调控HA的矿化 4

1.4.1 蛋白质调控下HA矿化的过程 4

1.4.2 与HA矿化相关的蛋白质 5

1.4.3 IDPs 5

1.4.4 IDPs对釉质中HA形成的调控 5

1.4.5 IDPs作用的潜在机制 6

1.4.5.1 磷酸钙纳米团簇或非晶态磷酸钙ACP的稳定化 6

1.4.5.2 IDPs帮助形成超分子结构 7

1.4.5.3 影响SIBLING蛋白质翻译后的过程 7

1.4.5.4 调节细胞内的蛋白质表达 7

1.5 调控HA矿化的肽序列 8

1.6 本论文的主要研究目的及意义 8

第2章 实验部分 10

2.1 小肽的设计 10

2.2 小肽的合成 10

2.3 实验试剂与设备 10

2.3.1 实验试剂 10

2.3.2 实验设备 11

2.4 实验部分 11

2.4.1 反应液的配制 11

2.4.2 样品的制备 11

2.4.3 样品的傅里叶全反射红外光谱 11

第3章 结果与讨论 13

3.1 小肽与羟基磷灰石的红外光谱 13

3.2 小肽与羟基磷灰石之间的相互作用分析 13

第四章 总结与展望 18

致 谢 21

  1. 绪论

生物矿化在自然界中普遍存在,羟基磷灰石是此过程中重要的产物之一。研究羟基磷灰石与多肽的作用可更好的了解羟基磷灰石的生物矿化,进一步解开生物矿化的秘密以帮助解决临床骨、牙齿问题提供科学依据,并对材料的仿生合成提供理论指导。 以下对生物矿化的研究进展做综述。

1.1 生物矿化概述

生物矿化是指以细胞产生的有机基质为模板,无机元素在细胞特定蛋白的参与下,经过形核、生长、相变,最后形成高度有序的矿物的过程。在生物体内,生物矿化的过程是极其复杂和精确的调控过程。在活生物体中,由细胞及其产生的细胞内和细胞外基质调控。用化学术语来说,矿物不会沉淀,除非它的溶解度超过其组分离子的浓度,温度或压力的变化,或增加表面和降低活化能的初始值来促使矿物形成。前体相,如预成核团和无定形磷酸钙可以在溶液中形成,从而降低活化能垒。在生物体内,细胞和血管系统是初始晶体形成时组分离子浓度增加的提供者。细胞内或细胞外基质还可以提供促进这种初始矿物沉积的表面。当矿物不需要时,矿化的抑制剂保护基质或细胞外基质将不被矿化,并且由细胞产生的酶修饰或除去。整个过程是非常复杂的,即使在最简单的生命体中,也存在相同的过程: 沉淀离子的局部浓度升高和细胞外基质的调节过程。

生物矿化有两种形式:一种是生物体代谢的产物直接与细胞内、外的阳离子形成矿物质,如一些藻类的细胞间文石;另一种是代谢产物在细胞的干预下,在胞外基质指导下形成的生物矿物,如骨骼、牙齿中羟基磷灰石的形成。按照这种分类,我们把生物矿化的类型分为两个:一、生物诱导的矿化,主要指生物的生命活动与周围环境相互作用下而引起的矿化过程。这种矿化的作用由于不在严格的生物细胞控制之下,形成的矿物晶体与无机沉淀矿物类似,该形式在原核生物和真菌中比较常见;二、生物控制的矿化,是指生物在不受外界环境影响的条件下,通过生理调节来控制矿物沉积的过程。

生物矿化在自然界中是一种普遍存在的现象,并且在六大类的生物分类领域中,每种分类都有生物可以产生生物矿物,现已发现了超过70种不一样的生物矿物。比如,自然界中的珍珠和贝壳,其主要成分是碳酸钙矿物,以方解石和霰石的形式存在。以贝壳为例,它的珍珠层微观结构显示:六边形的霰石晶体按一定规则相互堆砌于有机基质中。这样的结构给了贝壳很好的高韧性[1]

相对于高等动物的牙和骨来说,它的主要成分是由矿化的胶原纤维组成的。它的机理为:原胶原以三螺旋方式形成强度高的胶原原纤维,然后平行排列组成直径大概为4nm的胶原微纤维,这些胶原微纤维的表面和间隙吸附着纳米级别的羟基磷灰石晶体,形成表面矿化和间隙矿化;这些矿化的纤维再组装成胶原纤维束,纤维束再通过某一角度的叠加排列,最终形成了骨的显微结构[2]

生物矿化的最终结果是形成高度有序的矿物。在这个复杂的过程中,最核心的为细胞-矿物调控和有机-无机调控。在有机-无机调控方面形成了许多理论。比如,“无机-有机界面”理论[3, 4],“有机调控矿物形成”理论[5],“分子识别匹配”理论等[6,7]。这些理论都是以矿物的结晶原理作为基础,在有机基体上通过不断地探索一步一步发展完善起来的。

结晶原理:从热力学的角度来说,形核生长是一个从液相到固相转变的过程,其中伴随着能量的变化。固相和液相的吉布斯自由能总和,在结晶前后的变化,是诱导形核的主要动力。总体来说,形核过程分为异相形核和均相形核。均相形核:均质基体中自发的随机的形核过程,一般需要过冷或过热的条件。经典的形核理论认为:随着新相的形成,会产生固液界面,体系的自由能变化有两部分,一是出现固相,相转变产生的一个自发能量下降的过程(∆Gvlt; 0);二是界面的形成和生长而导致固液界面自由能上升的过程(∆Gslt; 0)。通过计算就能得出形核的临界半径。在形核过程中,特异性形核比非特异性形核更为普遍。一般情况,特异性形核发生在新相界面处,并且比非特异性形核所需的能量要小。在一些容易发生形核的区域,界面能降低,减少了形核能的壁垒,促进了形核的过程。界面促进形核的原因是:界面接触角大于0,促进了微小颗粒的形核生长。特异性形核中其自由能等于非特异性形核自由能乘与接触角函数,即∆Ghete= ∆Ghomo∗f(ω)。特异性形核所需团簇体积比非特异性形核要小得多。

生物矿化对生命体是非常重要的,特别是那些具有精细的微观结构,非常巧妙的组织而成的矿化硬组织,不但为生物提供了力学强度和结构支撑,而且还提供了许多重要的生物功能,如运动,保护,咬切等。

1.2 有机基质与形核生长

有机基质作为矿物生长的模板,它在形核的过程中,除了上述所说的湿润角降低系统的吉布斯自由能之外,它还可以起到降低活化能,调控晶体的形貌的作用。比如,牙釉质中的羟基磷灰石晶体排列成规则的晶棒状;贝壳中的文石沿着有机层的晶胞c轴方向优先生长;蛋壳,其主要成分是方解石晶体,它们沿着c轴优先生长。由此可知,在生物矿化时,具有特殊分子的基质可以调控矿化的择优取向,其机理为它可以降低某一晶体方向的活化能,从而矿化时晶体沿该方向优先生长。有机基质对矿物生长的指导可以分为以下几个方面:

1、晶格匹配:当有机基质与晶格的某一面的结构相似时即参数相近,能够相互匹配,那么在成核时它的活化能降低。晶体优先沿着此晶面生长,形成矿物。比如,蛋壳中的有机基质与方解石晶体参数相匹配,因此调控形成的大多数晶体为方解石,并且,这些方解石在同一面上,都有相同的取向。Falini 等人已经证明[8],矿物形成过程中,水溶性功能蛋白起着精密的调控作用,这些蛋白质含有大量的“2D2Y”重复序列,D为天冬氨酸,Y为非天冬氨酸。这种序列的多肽容易形成β折叠,其中天冬氨酸具有较强的负电性,可以捕获溶液中的钙离子,诱导形核。此外,β折叠相邻天冬氨酸的羟基与CaCO3(001)晶面的钙离子距离相近。这种理论也用于方解石,羟基磷灰石,文石等的解释。

图 1.1 具有β折叠的氨基酸结构域羟基磷灰石晶体的晶格匹配[9]

2、极性作用:由于分子的极性直接与界面能的大小有关,所以有机基体表面分子的极性与非极性基团可以影响晶体的形核与生长。因而,有机分子的极性影响矿物的形核过程主要是通过影响形核的活化能来达到的。

3、立体化学互补:无机离子与有机分子在矿化过程中,通过空间结构的互补,通过识别引发形核。比如,由于天冬氨酸空间上的手性便可使方解石产生手性。

空间定位:在生物矿化过程中,空间会控制和约束晶体的生长。在以有机界面为中心时,它的结构,尺寸,形态都受到约束。比如,形成的矿化隔室,限制了离子的运动空间,通过调控离子的运输来控制矿物的大小和形状。

4、静电作用:有机基质表面所携带的正电荷与负电荷能够促进晶体的形核。总的来说,带负电的有机基质能够吸附阳离子,然后通过阳离子吸附阴离子,使得局部浓度变大,当浓度增大到临界值时,晶体特异性形核。比如,调控人体矿化的非胶原蛋白,含有大量的天冬氨酸和谷氨酸,整体呈负电性。

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