乳腺微环境对乳腺发育的影响开题报告

 2020-02-10 10:02
1.目的及意义(含国内外的研究现状分析)

细胞微环境(cellmicroenvironment)是细胞赖以生存的复杂环境。由多种支持细胞及结缔组织组成的基质(stroma),是构成上皮细胞微环境的主要成分,对上皮细胞的命运决定及形态发生具有一定的决定性作用。

乳腺基质由细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和基质细胞构成。ECM 包括蛋白多糖,透明质酸,胶原,纤维粘连蛋白,层粘连蛋白等纤维蛋白,生长因子,趋化因子,细胞因子,抗体及代谢产物等。基质细胞主要包括成纤维细胞及脂肪细胞等支持细胞,血细胞以及免疫细胞。

乳腺成纤维细胞是构成乳腺上皮细胞微环境的重要成员,作为基质功能的主要行使者,调控乳腺上皮分支形态的发生。一方面,成纤维细胞分泌FGF(Fibroblast growth factor)、IGF(Insulin-likegrowth factor)等多种生长因子,这些生长因子结合于上皮细胞上相应的受体,直接影响上皮细胞存活、增殖、迁移等多种行为,促进上皮分枝状形态发生。另一方面,成纤维细胞通过调控细胞外基质的重构(ECM remodeling)间接影响上皮细胞的功能。作为调控乳腺细胞外基质的管家,成纤维细胞可以分泌胶原,蛋白多糖,纤维连接蛋白等多种细胞外基质的成分。同时,成纤维细胞还可以合成基质金属蛋白酶(metalloproteinases , MMPs)等蛋白酶,降解细胞外基质。通过调控基质的重构,不仅可以控制储存于细胞外质中的生长因子以及细胞因子的释放,还可以通过基质硬度的改变影响上皮细胞行为。因此,对于成纤维细胞的功能研究是阐明基质功能的重要方面。

哺乳动物中,FGF 家族包括22 个配体,以及FGFR1,2,3,4 四个受体。作为RTK 信号通路的重要成员,FGF 信号通路在乳腺中的研究由来已久。20年前FGF3,FGF4 和FGF8 便作为小鼠乳腺肿瘤基因被首度发现。FGFR2b以及FGF10 敲除后,小鼠无法形成乳腺基板,乳腺上皮细胞中敲除FGFR1 后,乳腺发育延缓。FGFR在乳腺分支的形态发生中必不可少。

综合目前国内外的研究进展,FGF 信号通路的作用仅局限于乳腺上皮细胞中,而在基质中的研究仍为空白。该课题通过构建目的基因敲除和过表达的体内、外模型,利用体外3D细胞培养等技术,进一步探究在乳腺成纤维细胞中FGFR的表达情况,以及FGF信号通路对乳腺发育不同时期的影响。该研究对于明确细胞微环境调控乳腺发育的机制、FGF信号通路在乳腺发育中的功能具有重要意义。

Keywords : mammary gland, stroma, FGFR signaling.


2.研究(设计)的基本内容、目标、拟采用的技术方案及措施

(一)基本内容及目标

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体及主要作用类型

2、探究基质中FGF信号通路在乳腺发育不同时期的影响

3、基质中FGFR1、FGFR2基因敲除、过表达小鼠的表型分析

(二)技术方案

1、验证乳腺基质中成纤维细胞存在FGFR受体

(1)从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞,种植于基质胶中,进行体外培养。

(2)实验组用FGF2刺激,对照组不加FGF2,培养3天,。

(3)观察纤维细胞迁移情况。

2、乳腺成纤维细胞中FGFR的表达分析

(1)从野生型小鼠中分离出乳腺成纤维细胞。

(2)提取细胞内总RNA并进行纯度分析,反转录成cDNA。

(3)设计相关引物,利用qPCR技术检测细胞中FGFR1,FGFR2,FGFR3,FGFR4表达情况

3、基质中FGFR1、FGFR2基因缺失对乳腺发育的影响

(1)体外模型——FGFR缺失对乳腺成纤维细胞的影响

①分离培养FGFR1 fl/fl、FGFR2 fl/fl、FGFR1,2 fl/fl小鼠的乳腺成纤维细胞,体外培养

②利用Cre-Loxp技术构建出FGFR1 KO,FGFR2 KO,FGFR1,2KO质粒载体

③腺病毒转染后,利用流式细胞仪和western blot技术分别筛选出FGFR1敲除、FGFR2敲除、FGFR1和FGFR2同时敲除的成纤维细胞,种植于基质胶中。

④FGF2刺激,培养3天,观察细胞迁移情况。

(2)小鼠模型——FGFR缺失的表型分析

①利用Fsp-Cre的小鼠与目的基因小鼠杂交,得到FGFR1 KO,FGFR2 KO,FGFR1,2KO的小鼠。

②分别于小鼠出生后3周、5周、10周及怀孕期取乳腺进行Carmine 染色。

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