细菌群感信号分子降解酶AidH的功能性表达及纯化研究开题报告

 2020-02-10 10:02

1. 研究目的与意义(文献综述)

群体感应 (quorum sensing,qs)是指细菌与细菌之间的通讯交流机制,通过分泌信号分子诱导细菌中特异性基因的表达,qs可以影响细菌的群体行为和生理生化特征 , 包括动植物致病菌的致病力、发光菌的生物发光性、共生、毒性因子表达、感受态、接合、 抗生素的产生、运动性、孢子形成以及生物膜的形成等。 qs控制着病原菌的致病性和某些细菌生物膜的形成,调控细菌的生命活动,表现细菌群体的反应和功能。细菌群感效应的淬灭就是指细菌群感效应的抑制方法。通过降解群感信号分子,有利于抑制生物膜的形成,提高现有抗菌策略的效率。n-酰基高丝氨酸内酯(ahls)是qs中最具特征的细胞-细胞通讯信号,降解ahls可有效抑制细菌群感效益,治疗感染的功效。

目前,国内外已在多种细菌中发现不同ahl降解酶,根据酶的催化机制分为ahl内脂酶、ahl酰化酶和ahl氧化酶,在这些酶中,α-内酯酶是近年来研究的热点。aidh是来自ochrobactrumsp. 的α/β水解酶折叠家族成员的一种新型n-酰高丝氨酸内酯酶,分子大小为29.5kda,具有水解ahl高丝氨酸内酯环酯键的作用,在破坏群体感应效益、预防和治疗感染方面具有很大的前景,与现有的ahl酶同源性很低,且与之前发现的ahl酶不同,它不具有金属结合基序,是一个非金属依赖的酶。目前已有关于aidh结构及作用机理的报道,aidh的总体结构为两域结构,由一个典型的α/β水解酶折叠核心域组成,该核心域由一个帽域覆盖,其活性位点是保守的丝氨酸蛋白酶型催化三联体:ser102、his248和glu219,通过活性部位与底物在质子化与去质子化过程中,达到水解内酯环的效果。冰核蛋白(ice nucleation protein, inp)是一种分泌性的外膜蛋白,其 n 端结构域负责锚定于细胞表面,因此可利用只含有 n 端结构域的 inp 在大肠杆菌表面展示外源蛋白。细菌表面展示技术已成为蛋白质研究领域的新技术,可用于呈现大分子蛋白,并能够使酶促反应在细胞表面直接发生从而大大提高反应效率,同时很好地避免宿主细胞胞内酶对外源蛋白的降解影响,克服某些反应产物在细胞内不能进行特定的构型折叠等弊端。

故而本研究利用只含有 n 端结构域的冰核蛋白在大肠杆菌表面展示aidh蛋白,构建、表达和纯化inp-aidh重组蛋白,探讨inp-aidh重组蛋白在抑菌、降解c6-hsl及研究inp-aidh对生物膜的抑制方面的功能,同时探讨对inp-aidh蛋白的固定化,旨在获得具有抑菌和治疗感染的材料,获得实用效益。

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2. 研究的基本内容与方案

研究(设计)的基本内容、目标:

为深入探讨aidh的功能及效益,本研究将利用只含有 n 端结构域的冰核蛋白在大肠杆菌表面展示aidh蛋白,构建重组蛋白inp-aidh,对inp-aidh重组蛋白进行表达、纯化,计划获得纯度95%以上的重组蛋白,并用以探讨

  1. inp-aidh重组蛋白在平板上的抑菌效果

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    3. 研究计划与安排

    第1周:了解论文题目,认识所需完成的主要内容和任务;搜集相关学术期刊、论文、文稿、专利、教材等资料,阅读后进行总结,对论题形成一个初步的系统性的认识。

    第2-3 周:完成毕业论文开题报告,确定实验技术路线,确定具体的实验方案和步骤。

    第4-8周:inp-aidh重组蛋白表达、纯化、固定化、抑菌实验、降解能力实验以及对生物膜的抑制。

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    4. 参考文献(12篇以上)

    [1] mei g-y, yan x-x,tuak a, et al.(2010) aidh, an alpha/beta-hydrolase fold family member from an ochrobactrumsp. strain, is a novel n-acylhomoserine lactonase. applied and environmentalmicrobiology, 76(15): 4933-4942.

    [2] gao a, mei gy, liu s, et al.(2012). high-resolution structures of aidh complexes provide insights into anovel catalytic mechanism for n-acyl homoserine lactonase. actacrystallographica. section d, biological crystallography, 69(pt 1) :82-91.

    [3] he l,wang s,geng x. coating and fusing cellmembranes onto a silica

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