微量热法研究N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖对微生物生长的作用外文翻译资料
2022-10-27 11:10
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微量热法研究N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖对微生物生长的作用
秦彩琴 李慧荣 方木 刘毅 陈新有 李强
摘要
壳聚糖和缩水甘油基三甲基氯化铵反应合成了水溶性的壳聚糖季铵盐。水溶性的壳聚糖季铵盐可以由傅立叶红外线变换仪和碳-13核磁共振谱鉴别。微量热法研究探讨了水溶性的壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌的抑菌效果。壳聚糖季铵盐的抗菌活性在碱性条件下较强，在酸性条件下较弱。
关键词: 壳聚糖；季铵盐；微量热法；微生物；抗菌活性
1.介绍
壳聚糖是天然无毒的高分子材料，由脱乙酰甲壳素而来，是甲壳类动物的主要组成部分，如蟹、 虾和嗉子。它在商业领域中受到极大的重视，尤其是在制药、化妆品、食品等领域。高级化妆品需要很高的保湿能力和抗菌能力，而且需要很宽的pH值范围，尤其是pH值在6以上，对于此，壳聚糖可以满足。
壳聚糖和壳聚糖的衍生物的抗菌活性已被人们研究出来。研究报告显示壳聚糖的抗菌活性仅在酸性介质中表现，因为当pH值在6.5以上时，壳聚糖的溶解度很小。对于壳聚糖作为添加剂添加在化妆品中来说，这是一个限制因素。
水溶性的壳聚糖季铵盐在酸性和碱性的生理环境中都能溶解，因此水溶性的壳聚糖季铵盐作为阳离子防腐剂可能是一个好的选择。研究显示由壳聚糖希夫碱与甲基碘化物反应得到的季铵盐有很强的抗菌活性，但是生产成本非常高，因为用到了昂贵的原料试剂，如：NaBH4和CH3I。
另一种壳聚糖季铵盐，它是由壳聚糖和缩水甘油三甲基氯化铵反应合成的，据报道，该种壳聚糖季铵盐具有很好的保湿能力，但是关于它的抗菌活性报道的研究较少。本研究的目的是探讨N-2-羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖对微生物生长的作用，以评估它在高级化妆品中作为天然防腐剂和抗菌剂的潜力。
金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌也许是人类研究最广泛的病原微生物。对于研究水溶性的壳聚糖季铵盐对这些病原微生物在体外生长的影响它们是一个不错的选择。这可以帮助我们了解这种物质可能对其他病原微生物的一般影响。
微量热法是一种有用的工具，它可以估计微生物细胞的生长活性的值，这是依据它们新陈代谢的热量变化来检测的。该方法可以进一步提供有关各种化学品抑菌和杀菌作用的信息。
在本文中，壳聚糖季铵盐由壳聚糖和缩水甘油三甲基氯化铵反应合成。此方法适合大规模生产，而且生产成本低。微量热法是用来测定壳聚糖季铵盐的抗菌活性的。
2. 实验
2.1. 试剂和器材
本实验中来源于河虾的壳聚糖作为初始材料从湖北裕丰生物工程股份有限公司(中国)购进。该壳聚糖的分子量平均是80.0times;104，N-脱乙酰度为95%。在实验室其他指定地方我们会制备缩水甘油基三甲基氯化铵(GTMAC)。其他化学品均为分析纯。在日本岛津产的FTIR-8210分光光度计上，红外光谱用 KBr 丸石测量。13C核磁共振谱上的样品在水中被记录在汞400质谱仪上。
TAM Air (一个八通道等温批量工作热量计测量热流，最小可以检测出 2 mu;W)产于瑞典的Thermometric AB公司，它可以用于获得微生物生长的能量与时间的关系变化曲线。PicoLog软件(Pico技术有限公司)是用来处理数据的。
LB培养基的条件: 5 g氯化钠，10 g胰蛋白酶，5 g/L的酵母提取物，pH 值为7.0，在120摄氏度的高温灭菌下灭菌20分钟。
金黄色葡萄球菌(CCTCC AB910393)和大肠杆菌(CCTCC AB91112)由中国武汉大学中国典型培养基培养中心提供。白色念珠菌由中国湖北省人民医院提供。这三株在37摄氏度的营养肉汤中固定生长，便于细菌滋生，白色念珠菌的为 30摄氏度，这些悬浮物被用作微生物检定法的接种。
2.2. 水溶性 N-乙酰化壳聚糖的制备(CT50)
取壳聚糖(5 g)溶于150毫升3%(w/w)的醋酸水溶液中，加醋酸酐。搅拌 10小时后，通过添加KOH，将反应混合物的pH值调至9，然后过滤。滤液集中、 沉淀，再用乙醇洗涤，然后在真空60摄氏度下干燥48小时。通过微量热法测得得到的水溶性壳聚糖CT50 N-乙酰化度为51.2%。
2.3. 壳聚糖季铵盐(QTS)的合成
纯壳聚糖(16.0 g)溶于200毫升水中，添加GTMAC(0.4mol)，并将混合物在80摄氏度下搅拌24 h。反应产物均过滤、集中、透析、浓缩，用乙醇和丙酮沉淀，然后在真空条件60摄氏度下干燥48 h，获得壳聚糖季铵盐QTS。
2.4. 水溶性测定
样本的水溶解度测定如下。取称重的样本(0.2 g)悬浮在10毫升蒸馏水中，在25摄氏度条件下震荡2 h。可溶性壳聚糖是通过离心去除的。沉淀干燥后称量。样品在水中的溶解度通过溶解样本的百分比来确定。
样品依赖于水溶解度的pH值通过浊度测量法来测定。测试的样品(20毫克) 溶解在1%的醋酸溶液(10毫升)中。慢慢加入NaOH溶液，溶液的透光率通过UV 1601分光光度计记录，这个过程中使用了600 nm条件下光路长度为1厘米的石英细胞。
2.5. 批量实验的抑菌活性微量热法研究
轻轻地摇晃，接种体比较均匀地分布在50 mL的LB培养基中。接近5毫升的悬浮液加入到20毫升密封的小玻璃管中，小玻璃管中含被测的样本，所有小玻璃管被贴上了标签。小玻璃管都被放在热量计中，在细菌的成长过程中检测到的信号都会被收集起来。细菌的实验温度设为37摄氏度，白色念珠菌的实验温度设为30摄氏度。
2.6. 失活微生物的批量实验
菌株长大直到固定相在营养肉汤中。细胞通过离心法获得，然后用无菌生理盐水(0.9%)溶液洗涤并稀释。在25摄氏度下，将全部悬浮液加入到无菌生理盐水溶液中，该无菌生理盐水溶液中含季铵化壳聚糖。在24小时后，细胞离心，并用无菌生理盐水冲洗。将这些获得的细胞加入到LB培养基中，细菌各自在37摄氏度下培养24小时，白色念珠菌在30摄氏度下培养48小时。微生物的生长速度会被估计，它会自动呈现在电脑屏幕上，在人工培养基中620 nm分光光度计下测量。
图1 壳聚糖季铵盐的结构
3. 结果和讨论
3.1. 壳聚糖季铵盐的制备与特征
壳聚糖与GTMAC在水中会发生N-取代(图1)。由图可知取代度为0.85。
本实验中壳聚糖CTS和壳聚糖季铵盐QTS的红外光谱如图2所示。壳聚糖 CTS的吸收带在1656 cm－1处被引用作为酰胺I带，并在1600 cm－1的吸收带归因于伯胺的N-H弯曲模式。QTS的—NH2吸收带几乎消失，这表明N-烷基化在CTS中发生。与CTS相比，壳聚糖季铵盐QTS在1480 cm－1有一吸收带，这是因为甲基铵化。
壳聚糖季铵盐QTS的13C核磁共振谱如图3所示。在较低的领域的最底端峰值delta;=102.6 ppm，这是因为有异C-1。在delta;=78.0，75.1，73.5，65.1和60.2 ppm较宽的领域有信号，这是因为有C-4，C-5，C-3，C-2和C-6。在delta;=54.6 ppm处有最高峰，这是最重要的一个信号，它标志着有三甲基铵基团的C-10。较高领域在delta;=52.1 ppm处有信号，这是因为有C-7，而较低的领域在delta;=69.5 ppm处有信号，这是因为有C-9。在delta;=65.4 和65.8 ppm处有信号，这是因为有C-8。
3.2. 壳聚糖季铵盐的水溶性
本实验中的壳聚糖CTS是不溶于水。经过季铵化后，壳聚糖变成水溶性的电解质，其电荷密度很高，所以2%的壳聚糖季铵盐QTS溶液很清澈。图4显示了0.2%的壳聚糖季铵盐QTS溶液在pH范围为3-12的溶解性。
3.3.壳聚糖季铵盐对其抑菌活性的影响
图5-7分别展示了白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长过程中能量与时间关系的曲线。量热功率P，反映了细胞增长的快慢，它可以作为一个参数来计算细胞增长的速度。因为P=dQ/dt,曲线下方的面积表示在实验期间的热输出Q。
与对照组相比，添加CT50导致了最大量热功率Pm在生物生长期间的值变大，这表明CT50可以促进这些微生物的增长。但是，壳聚糖季铵盐QTS的出现，导致了在生长过程中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的能量-时间曲线变成了直线，这表明微生物的生长完全被抑制；生长过程中大肠杆菌的Pm值也明显减少，滞后期变长，这表明壳聚糖季铵盐QTS也有对大肠杆菌的抑制作用。这些结果进一步表明，在酸性介质中壳聚糖的抗菌活性，主要是因为阳离子效应。当pH值在7以上时，壳聚糖不再具有抗菌活性，这是由于带电氨基酸基团，而不是因为其溶解性差。
3.4.壳聚糖季铵盐对白色念珠菌的抑制作用
来源于52 h白色念珠菌的生长能量与时间的曲线的热量输出Q都被计算出来了，并在表1中列出。当白色念珠菌的接种物有1 mu;L时，加入的壳聚糖季铵盐QTS浓度达到175微克/毫升时，热量-时间曲线变为一条直线，细胞几乎没有增长，Q的值下降到零。很明显，随着壳聚糖季铵盐QTS浓度的增加，Q的值减小。当加入的接种体增加到3 mu;L时，壳聚糖季铵盐QTS浓度为700 mu;g/ml，细胞保持增长。众所周知，当培养基变成碱性时，白色念珠菌的生长增加。相比之下，在壳聚糖季铵盐QTS存在的条件下，细胞在弱碱性介质中比在酸性介质中生长慢。
3.5.壳聚糖季铵盐对金黄色葡萄球菌的抑制作用
壳聚糖季铵盐QTS不同浓度下的热量输出Q都被列在表2中，这些数据来源于金黄色葡萄球菌11 h的热量-时间曲线。当接种体的剂量为1.0 mu;L，壳聚糖季铵盐QTS的浓度为70 微克/毫升，金黄色葡萄球菌的生长完全被抑制，热量-时间曲线成为一条直线， Q的值变为零。当增加两倍剂量的接种体后，壳聚糖季铵盐QTS浓度为200 mu;g/ml，细胞仍然生长。为了完全抑制细胞的生长，壳聚糖季铵盐QTS的浓度不得不增加到400微克/毫升。在这两种情况下，Q随着壳聚糖季铵盐QTS浓度的增加而减小。
如图8所示，加入20 mM氢氧化钠的金黄色葡萄球菌的曲线的形状与对照组类似，加入20 mM HCl的金黄色葡萄球菌生长受到抑制。当壳聚糖季铵盐QTS浓度为280微克/毫升时，添加20 mM NaOH进一步抑制了细胞的生长，而加入20 mM HCl反而促进了微生物的生长。这些结果表明，在弱碱性介质中，壳聚糖季铵盐QTS对金黄色葡萄球菌有更好的抑菌作用。
3.6.壳聚糖季铵盐对大肠杆菌生长的抑制作用
大肠杆菌8 h的来源于热量-时间曲线的热量输出Q在表3中列出。与对照相比，随着氢氧化钠的增加，Q的值增加，随着盐酸或醋酸的增加，Q的值减小，这表明，大肠杆菌在弱碱性介质中比在弱酸性介质中生长快。但是，壳聚糖季铵盐QTS存在的条件下，随着氢氧化钠的增加，Q的值减少，随着盐酸的增加，Q的值增加。表 4也显示了在含有壳聚糖季铵盐QTS的培养基中，随着氢氧化钠浓度的增加，Q的值减小。这些结果表明，较弱的酸性条件减弱壳聚糖季铵盐QTS的抑菌活性，较弱的碱性条件增加壳聚糖季铵盐QTS的抗菌活性。
当添加10 mM氢氧化钠后，Q的值随着壳聚糖季铵盐QTS的浓度的增加而减小。当壳聚糖季铵盐QTS浓度达到10 毫克/毫升时，热量-时间曲线变成一条直线，这表明细菌的生长完全被抑制。当壳聚糖季铵盐QTS的浓度增加时，壳聚糖季铵盐QTS的抑菌活性增强。
3.7. 微生物在含QTS的盐溶液中失活
随着细胞繁殖，介质会变得很混浊，因此光学密度可用作为参数测量细胞的生长。在微生物都被壳聚糖季铵盐QTS作用过后，微生物在LB培养基中的生长由分光光度计在吸光度的培养液的620 nm下进行测量。通过表5中的数据，壳聚糖季铵盐QTS存在下的抑菌活性不是很强。大肠杆菌没有被壳聚糖季铵盐QTS杀死，即使是在高浓度下处理24小时，这表明壳聚糖季铵盐QTS具有低毒性。
3.8. QTS抗菌作用的模式探讨
阳离子抗菌剂已被广泛应用，尤其是外部消毒。阳离子生物杀灭剂的目标地点是细菌的细胞膜。据报道，阳离子消毒剂的目标地点是微生物的细胞质膜。细胞质膜的主要成分是膜蛋白和磷脂。
壳聚糖季铵盐QTS对微生物的抗菌活性应该被考虑，因为它们的化学和结构特性。聚合物大分子是无法通过外膜的，因为膜作为一个屏障可以挡住生物大分子进入细胞膜。阳离子型的高分子的抗菌作用模式可能是带正电的阳离子与阴离子相互作用，细胞表面的阴离子组成(多糖、蛋白质)很多，它们与阳离子相互作用导致细胞膜透过率的改变，使得细胞膜的屏障功能消失。聚阳离子分子结合已被证实是破坏外部膜的完整性，从而导致膜屏障功能的消失，但缺乏直接的杀菌活性。本文中的实验数据也提供证据表明壳聚糖季铵盐QTS具有抑菌活性，及很弱的杀菌剂活性。
这些研究结果也显示，壳聚糖季铵盐QTS的抗菌活性在弱碱性条件下，比在弱酸性条件下强，这与一般的季铵盐消毒剂的规则相吻合。在碱性培养基中，微生物的蛋白质可以携带更多的负电荷，这增强了壳聚糖季铵盐QTS的阳离子与细菌细胞的细胞质膜之间的相互作用。在酸性培养基中，C2 和C7之间的—NH—也可以形成壳聚糖季铵盐QTS分子中的阳离子，从而导致分子和磷脂之间的疏水相互作用减弱，并进一步
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