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石墨烯增强了聚合酶链式反应的特异性外文翻译资料

 2022-07-21 03:07  

英语原文共 5 页,剩余内容已隐藏,支付完成后下载完整资料


石墨烯增强了聚合酶链式反应的特异性

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外DNA扩增方法,自1985年由Kary Mullis开发以来,已经成为现代生命科学中最重要的技术之一。PCR可用于指数生成大量在数小时内从少量的DNA模板中获得DNA拷贝的数量。 然而,通常会产生非特异性的DNA片段,特别是在多轮PCR中,PCR的扩增效率降低。实际操作中,聚合酶链式反应(PCR)存在某些局限性,如重复性差、扩增效率低等问题。由于传统方法的局限性,PCR扩增仍然是一个挑战。虽然有一些矛盾的报道,但是可以得出这样的结论:添加剂的优异的比表面积,电子转移和传热性能将改善PCR的特异性。因此,采用不同的添加剂来提高PCR反应的特异性。随着纳米技术的发展,纳米材料的表面和尺寸特性已经显示出对生物大分子如蛋白质和核酸的结构和功能有特殊的影响。因此,研究纳米材料优化PCR的方法和技术对于学术和应用都是非常重要的。其中石墨烯作为一种新兴纳米材料,具有特殊的表面效应和尺寸效应,能够进行多种修饰,易与生物大分子蛋白质、核酸等相互作用,对提高PCR扩增特异性和效率都有明显的效果,具有非常重要的理论意义和应用价值。

石墨烯是二维单原子厚平面片状的sp2键碳原子,密集堆积在蜂窝晶格结构中。石墨烯具有很高的表面积,具有显着的机械,热传导和电子传递性能,使其成为生物应用的优秀候选者。由氧化石墨烯(GO)衍生的还原的氧化石墨烯(RGO)可以容易地以低成本和高产量制备,并且也可以分散在不含任何稳定剂的水溶液中,否则通常会影响PCR扩增的特异性和扩增效率。

在这里,我们报告了一种新型的PCR方法,使用廉价和容易准备的石墨烯,有效地提高了PCR反应的特异性。GO和RGO的制备和表征参见支持信息,图S1-5。

PCR体系的基本组成包括缓冲液系统(reaction buffer system)、待扩增的DNA模板(template)、特定序列的引物(primers)、耐热的DNA聚合酶(thermostable DNApolymerase)、4种脱氧核糖核苷酸的底物(dNTP),这些成份都是保证PCR顺利进行的必要条件。除此以外,为了达到某些特殊的扩增要求,有时也会加入一些小分子或纳米材料用来抑制或促进PCR的进行。在我们的PCR系统中,我们使用来自pET-32a质粒DNA的300bp片段作为模板。第一轮扩增后,将每一轮扩增的PCR产物作为下一轮扩增的模板。当GO浓度低于12ug/ mL时,特异性没有增强(图1a)。引人注目的是,随着GO浓度的增加,仅观察到一条特异性条带,并且非特异性条带消失。然而,当向PCR混合物中加入过量的GO(gt;70ug/ mL)时,PCR反应完全被抑制。结果表明,GO可以提高12 – 60ug/ mL浓度范围内的PCR特异性。然后,我们使用第一轮产品作为模板进行第二轮PCR来研究GO对第二轮PCR特异性的影响(图1b)。遗憾的是,在广泛的浓度范围内(2-60ug/ mL)我们没有观察到明显的特异性增强。结果提示GO不能增强两轮PCR的特异性。与GO相比,RGO提高了第一轮和第二轮PCR的特异性。在第一轮PCR中(图1c),随着RGO浓度的增加,非特异性片段逐渐消失。与GO的情况类似,在更高浓度的RGO(ge;14ug/ mL)时PCR被抑制。在第二轮PCR(图1d)中,当RGO浓度高于10ug/ mL时,非特异性片段几乎消失。因此,RGO可以增强第二轮PCR的特异性。

我们进一步进行了9轮PCR以验证RGO对PCR的特异性增强(图2)。在没有RGO的情况下,非特异性扩增产物趋向于从第二轮开始积累,并且在第三轮以后获得较少的产物。令人鼓舞的是,这种重复的扩增可以显着改善,增加12ug/mL RGO到第八轮。尽管也产生了轻微的非特异性条带,但在第八轮扩增中明显观察到了主要的目标条带,与没有RGO的正常重复PCR中的非特异性条带形成鲜明对比。连续转移到新的反应溶液中之前,PCR结果未被纯化。 RGO在第九轮扩增之前很好地抵抗PCR过程的降解产物和副产物的存在。重复PCR的高度特异性取决于RGO的浓度。我们调查了其他浓度的RGO,并确认12ug/ mL RGO是最佳浓度,以便在我们的重复PCR系统中保持高特异性。

为了进一步证实RGO对PCR特异性的影响,我们使用另一种在RGO不存在的情况下具有低特异性的PCR系统。 从健康志愿者的血样中分离的人基因组DNA扩增794bp线粒体DNA。 在溴化乙锭染色的凝胶中观察到多个非特异性片段(泳道C,图3)。 当加入少量的RGO(8mu;g/ mL)时,涂片带逐渐减少,观察到对应于794bp靶DNA的单一优势带。 然而,当过量的RGO(12mu;g/ mL)加入到PCR混合物中时,PCR被完全抑制。 因此,进一步证实了RGO明显降低了非特异性PCR产物,RGO的浓度是提高PCR特异性的关键因素。

退火温度对PCR特异性有很大的影响。 不适当的退火温度会导致非特异性PCR产物。 因此,我们研究了在不同的退火温度(从52到25°C)下RGO存在下PCR的扩增特异性(图4)。 结果表明,可以在低至25℃的退火温度下获得具有较小拖尾带的目标产物。相比之下,不添加GO的PCR在退火温度低于45℃时不显示目标条带。大量涂抹 可以在凝胶上观察到,表明产生了多种非特异性产物。 常规PCR需要复杂的程序来寻找PCR的最佳退火温度。 在这项研究中,我们发现RGO辅助PCR即使在较低的退火温度下也能进行可靠的扩增,这优于传统的PCR,为了确保特异性,需要严格的退火温度。

PCR的保真度是生物医学应用的重要因素。 因此,有必要研究RGO辅助PCR的保真度。 图6中显示了794bp PCR产物的测序结果,证明RGO的加入并不妨碍PCR体系的保真度; 事实上,它与使用Pfu DNA聚合酶的普通PCR系统具有类似的保真度。 因此,RGO不仅可以增强PCR的特异性,而且还能保持其坚固性。

在这项研究中,我们已经证明GO和RGO可以提高PCR的特异性,尽管GO的性能比RGO差。因此,我们认为RGO的增强效应可以解释如下。首先,RGO和Pfu DNA聚合酶的相互作用在提高PCR的特异性方面起主导作用。我们测量了Zeta电位为0.1 mg/mL石墨烯和石墨烯-Pfu DNA聚合酶,以证实这一结论(图S7)。 GO和RGO溶液的Zeta电位分别为-41和-20.3mV。加入10mu;LPfu聚合酶后,分别变为-16.6和5.39mV。相比之下,加入相同体积的脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)和Pfu缓冲液后,石墨烯的zeta;电位几乎没有变化。据我们所知,小分子首先比大分子(Pfu聚合酶)具有更快的吸附动力学,但最初吸附的小分子会被Pfu聚合酶置换,导致石墨烯的负电荷减少。如方案1所示,RGO-Pfu的最终带正电的复合物将有利于将带负电荷的DNA模板和引物吸引到RGO板上并促进引物退火和延伸。因此错配概率降低,PCR特异性提高。为了进一步证实这一结论,将不同浓度的牛血清白蛋白(BSA)加入PCR系统(图5)。随着BSA浓度的增加观察到非特异性条带。其结果可能是由于BSA破坏了RGO和DNA聚合酶之间的相互作用。其次,负电荷的GO经历阴离子DNA链的静电排斥。由于双链DNA(dsDNA)具有比单链DNA(ssDNA)更高的电荷密度,因此dsDNA和GO之间的排斥力比ssDNA和GO之间的斥力更强。幸运的是,由于胺基团的化学修饰(如傅里叶变换红外(FTIR)和X射线光电子能谱(XPS)),RGO不带负电荷,因此DNA链与RGO之间的强烈斥力不会发生。见支持信息)。通过茚三酮反应和Boehm滴定测定,RGO中胺基,羧基和羟基的含量分别为7.20%,5.29%和2.55%。同时,RGO的多环芳烃结构比GO更为完善。因此,核碱基中的环结构与RGO的六角形细胞之间可能存在强烈的pi;-堆积相互作用。因此RGO比DNA具有更大的与DNA链的亲和力。第三,RGO具有非常高的导热系数(5300 W m-1)[18],这表明RGO辅助的PCR系统在加热/冷却过程中可以迅速达到热平衡。因此,PCR系统的温度会更均匀,热块温度与样品温度之间的时间延迟也可能会缩短。

总之,本研究首次表明RGO可以显着提高PCR的特异性。 我们已经证明RGO在提高特异性方面将胜过GO。 甚至在八轮重复扩增之后,PCR特异性仍可保留。 石墨烯辅助PCR允许在低退火温度下可靠的扩增。我们还阐明了RGO对PCR特异性的增强作用可能是由于石墨烯对DNA和聚合酶的高度亲和力以及石墨烯非常高的热导率。

实验部分

材料:改性Hummers法由石墨合成石墨氧化物。 RGO用氨水和水合肼作为还原剂制备。 pET-32a质粒DNA得自Novegan。根据高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche,Germany)的方案从健康志愿者的血液样品中分离人类基因组DNA。 Pfu聚合酶,引物和PCR试剂购自Sangon Biotech,P.R.of China。

表征:在Phi Quantum 2000 X射线光电子能谱仪上记录XPS谱。材料的晶体结构通过配备有Cu Kalpha;辐射(lambda;= 0.1541nm)的粉末X射线衍射(XRD)系统(Philips PANalytical X#39;Pert)测定。在具有1nm分辨率的Beckman H800分光光度计上收集UV-vis光谱光谱。样品的FTIR光谱在室温下在Nicolet AVATR 360 FTIR光谱仪上记录。原子力显微镜(AFM)图像采用安捷伦5500原子力显微镜拍打模式拍摄。通过Malvern Nano-ZS测量Zeta电位。

PCR:在我们的模型重复PCR系统(9轮PCR)中,正向引物P1 5#39;-GCC ATG GAT CAC AAG CAT CAT GAT CAC-3#39;和反向引物P2 5#39;-GCC TCG AGG CAG AAA CAG TCG CAG T被用于扩增来自pET-32a质粒DNA(来自Novegan)的300bp片段。根据高纯度PCR模板制备试剂盒(Roche,Germany)的方案从健康志愿者的血液样品中分离人类基因组DNA。使用正向引物5#39;-AAC TAC GAT AGC CCT TAT GAA-3#39;和反向引物5#39;-GGC CTA CTA TGG GTG TTA AA-3#39;扩增来自人基因组DNA的794bp片段的线粒体。重复PCR系统中所有试剂的最佳量在第一轮中在最终的200mu;L薄壁管中在25mu;L的最终体积中混合,根据以下最终条件:1times;PCR缓冲液,dNTP (0.2mu;M),每个引物(0.4mu;M),质粒DNA(20 ng/mu;L -)和Pfu DNA聚合酶(0.1U/mu;L )。将样品用GO或RGO和双蒸水的水悬浮液配成最终体积。在随后的8轮PCR中,使用的试剂与第一轮中的相同,不同之处在于用前一轮PCR产物(0.4mu;L)代替质粒DNA。 PCR条件如下:1)94℃5分钟(初始变性); 2)在94℃30秒(变性),65℃30秒(退火)和72℃1分钟(延伸)进行31个循环; 3)72℃10分钟(最后一次延伸)。人类基因组DNA反应条件如下:1)94℃10分钟(初始变性); 2)在94℃45秒(变性),52℃45秒(退火)和72℃90秒(延伸)34个循环; 3)72℃5分钟(最后的延伸)。在PCR反应的不同退火温度的实验中,退火温度分别降低到45,40,35,30和25℃。

茚三酮反应:茚三酮反应如下:茚三酮(2wt%)乙醇溶液(400mu;L),K3PO4缓冲液(1200mu;L,50mmol/L,pH8.0)和L-赖氨酸溶液400mu;L,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9mmol/ L )分别加入到2mL离心管中。将混合物完全混合并煮沸15分钟。然后在450nm处测量混合物的UV-vis吸光度并形成标准曲线。除了用RGO溶液(0.1mg /mL)代替L-赖氨酸溶液(400mu;L)之外,如上处理RGO。然后测量上清液的吸光度,根据标准曲线测定胺基团的浓度。 RGO中胺基的量是7.2%。 Boehm滴定:为了确定RGO中的羧基和羟基的量,按照Boehm方法进行Boehm滴定。 RGO中的羧基和羟基的量分别为5.29%和2.55%。

通过NaOH变性后,高度富含GO的DNA模板的PCR扩增

通过聚合酶链式反应进行的DNA扩增已经成为分子生物学日益重要的工具(1)。然而,高GC含量的模板DNA可能构成该技术的显着限制。以前,在PCR中利用共溶剂,甲酰胺(2)或甘油(3)显着提高扩增的特异性。最近,推荐使用天然而非重组Pfu DNA聚合酶的一般方法来扩增非常高GC含量的区域(4)。在本研究中,我们显示模板用NaOH进行变性是高度富含GC模板的PCR扩增所必需的。

我们一直在研究人内源性逆转录病毒序列HRES-1(5,6,EMBL登录号X16514)的遗传多态性和表达。基本上如前所述进行PCR反应(7)。我们尝试使用PCR条件例如MgCl 2,浓度(在1.5-4mM之间)的常规变化来扩增高度富含GC的HRES-1区域(GC含量在核苷酸位置1158和1266之间的81%),变性(95-97℃)和退火(37-62℃)的温度范围宽,不能产生任何扩增。使用引物对HRES-1 / FW(5#39;-ATGCCAGGACAGATGGAG-3#39;)和HRES-1 / REV 5#39;-TGCGGGGGTCTTGAGGGT-3#39;)在HRES-1的核苷酸位置400至1294之间进行PCR扩增。作为25pg〜250ng含克隆HRES-1质粒的模板,使用HRES-1/1(5),引物浓度从100pM变化到1mM。甚至使用末端标记的寡核苷酸HRES-1 / REVb(5#39;-ACTTGTACTTTGTATCAG-3#39;,对应于核苷酸位置575-558)的Southern印迹分析也不能检测到预期的895bp片段。分别或组合使用Ampliwax / Hotstart系统(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)加入到甲酰胺(2.5-10%)或甘油(5-10%)的反应混合物中,

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