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Strong Acidophile Thiobacillus ferrooxidans对胞外聚合物的作用和分析

Wolfgang Sand bull; Tilman Gehrke

1介绍

胞外聚合物在许多过程中发挥关键作用(COSTERTON 1985)。它们的重要性常常不为人所知。我们最近开始认识到胞外聚合物功能的一个过程，即贵金属的

生物浸出及其对酸矿/岩石排水的有害影响。

高效专性菌氧化不溶性金属硫化物以获得代谢能量。这种氧化的最终产物是硫酸和溶解的金属离子。这种称为生物浸出的过程能从低品位硫化矿中回收（溶解）贵金属如Cu² ，Zn² ，Co² ，U⁶ 或Au。在大多数情况下，此过程对环境有一个负面影响，称为酸矿/岩石排水。这是由这些最终产物对水和土壤的污染造成的。因为当贵金属回收时，浸出过程是不停止的，它继续进行直到所有金属硫化物分解完毕。因此，低价值化合物如硫化铁在来自矿井的废物中被氧化，并产生含有溶解重金属的强酸性水。通常情况下，这些释放过程没有任何控制，因此它们对环境构成了严重的威胁。为了减轻ARD，我们需要知道溶解的基本过程。

2 浸矿细菌

负责该溶解过程的细菌主要来自于两种物种：Thiobacillus ferrooxidans 和/或Leptospirillum ferrooxidans。许多其他物种也可能有贡献，但是这里主要讨论由这两个物种影响的过程。他们将Fe² 氧化为Fe³ ，而Fe³ 是金属硫化物的强氧化剂。两种细菌的功能是保持铁离子主要处于氧化状态，并保证它的氧化能力。Leptospirillum ferrooxidans是少数只有一种能量来源的细菌之一，它通过氧化Fe² 离子而获得能量。 Thiobacillus ferrooxidans则可以另外氧化硫化物，使其在更大种类的营养物上生长。 为了保持铁离子处于（有效）可溶状态，pH必须低。

因此，这些细菌生活在pH值为1和3之间的环境中，有时甚至可以检测到它们

在PH值更低的环境下生活。它们的细胞碳来源于卡尔文循环中CO₂的固定。 仅在Thiobacillus ferrooxidans的菌株中能检测到羧基端体（图3b）。 总之，代谢是需要强酸性条件的完全化学自养型的一个实例。 大多数工作都由Thiobacillus ferrooxidans完成，因为这种细菌自1950年以来就被人们所知（COLMER ET AL.1950）。Leptospirillum ferrooxidans仅在1972年被检测到（MARKOSYAN

1972），并且由于其特殊的生长要求，在纯培养物中更难获得（SAND ET AL.1992）。因此，使用Thiobacillus ferrooxidans的菌株完成了关于这些特定生物体代谢的大多数工作。我们选择Thiobacillus ferrooxidans的一种菌株用于其胞外聚合物的化学和功能分析。

3金属硫化物的溶解

在（生物）浸出过程中，大多数金属硫化物被质子和/或Fe³ 离子的组合攻击而溶解。如SCHIPPERS（1998）所述的机理，在一种情况下金属硫化物通过酸水解与H₂S /多硫化物形成间歇阶段结合，随后形成硫。硫形成的最后一步是与Fe³ 的还原相结合。因此，像ZnS或PbS这样的金属硫化物的第一降解产物主要为硫元素。其他（少量）金属硫化物（黄铁矿，辉钼矿和钨铁矿—FeS₂，MoS₂，WS₂）只能通过Fe³ 离子的氧化作用降解。他们的第一个硫中间体是硫代硫酸盐，其在连续的反应中通过四硫代硫酸盐和三硫代硫酸盐产生硫酸盐（SCHIPPERS ET AL.1996）。在这里并不是讨论过去的有关直接/间接浸出机理。根据上述涉及质子和/或Fe³ 离子的机理，间接浸出机理是唯一能够解释与生物浸出相关现象的理论（SAND ET AL.1995）。酶/酶复合物氧化的理论假设中没有任何可检测到的中间体，只有通过将氧、金属硫化物掺入硫酸盐和金属离子中，即所谓的直接浸出机制，才能检测到中间体。目前还没有证据能证明这个理论。 只有在间接技术基础上模棱两可的结果，如扣除氧监测实验获得的反应数据，来支持这一理论。

特别地，由于Leptospirillum ferrooxidans快速且牢固地附着到金属硫化物表面，所以附着于基础金属硫化物的论据是必需的(GROUDEV 1979; LUNDGREN AND SILVER 1980; EHRLICH 1996)，由此可见直接机制的指示是无效的。然而，这种细菌是已知的只能够通过氧化将Fe² 转化为Fe3 离子的细菌。后者基本上包括间接机制。

以下方程（方程1-5）总结了间接机制对浸出反应的知识现状。 金属硫化物

应该分为两组。 第一组主要的降解中间体是硫代硫酸盐，而另一个是多硫化物。 黄铁矿（FeS₂）属于第一组，闪锌矿（ZnS）则属于第二组（SCHIPPERS 1998）。

硫代硫酸盐机制：

更多关于过去对直接/间接机制探讨的细节，读者可以参考EHRLICH（1996）。

从这些方程可以看出，Fe³ 离子对于该过程至关重要。不知何故，电池必须在这些离子靠近晶体表面时才能开始降解过程。这只能通过复合，然后运输到金属硫化物表面才能实现。因此，此过程需要附着是显而易见的。胞外聚合物通常参与到表面的附着。 已知胞外聚合物涉及微生物侵蚀腐蚀（MIC）（GEESEY 1991; SAND 1995）等过程，有时即使没有活细胞也会发挥作用。图4分别显示了通过原子力显微镜获得的Thiobacillus ferrooxidans和Leptospirillum ferrooxidans的4个图像。细胞附着在黄铁矿表面，很明显可以看到后者的缺陷。

显然，该过程是需要附着的。在这个过程中胞外聚合物的组成和功能的问题变得无处不在。

4 胞外聚合物的分析

为了研究与不同代谢底物附着的胞外聚合物的组成，我们选择Thiobacillus ferrooxidans的菌株R1。这种菌株起源于罗马尼亚的矿山栖息地（SAND ET AL。1992）。 胞外聚合物分离时，首先将菌株在含有亚铁（作为硫酸盐）或固体（如细磨）黄铁矿或硫的培养基上培养。然后通过离心培养悬浮液收获来自浮游（硫酸铁（II）生长的）细胞的胞外聚合物。除了在弱洗涤剂和金属络合剂的存在下需要还原基质淤浆的均质化步骤之外，其他都以相同的方式获得来自（黄铁矿或硫附着）固硫细胞的胞外聚合物。所得含有胞外聚合物的上清液被广泛透析并冷冻（原始胞外聚合物）。对于随后的化学表征，通过气液色谱（检测有机成分）和分光光度测定（检测诸如磷，氮或铁物质的元素）来分析粗胞外聚合物提取物。这些分析的结果在表1中给出。通常，胞外聚合物由糖和脂质组成。由于脂质含量高，胞外聚合物明显在黄铁矿表面的粘稠材料上积累（主要是含有碳水化合物

的胞外聚合物会发生弥漫性积累;图5）。此外，可检测到一些氮，磷和游离（可提取的）脂肪酸（FFA）。然而，硫酸铁或硫铁矿上生长的细胞中的胞外聚合物的化学成分基本没有差异。在生长细胞中可检测到更高含量的结合脂肪酸，游离脂肪酸和磷（表示外源磷脂） 与硫。无论生长底物如何，蛋白质和己糖胺都不可检测（数据未显示）。通常低氮含量表明，可能存在其它微量的未鉴定的N-化合物（例如核酸）。

所有三种类型细胞的糖和脂质部分的成分如表2所示，其中包括FFA单体的数据。从铁（II）硫酸盐生长的细胞糖分数据显示存在中性糖，葡萄糖醛酸和铁，而铁是铁（III）离子。由此可推定出葡萄糖醛酸分子是碳水化合物部分的一部分。摩尔比为2摩尔葡萄糖醛酸比1摩尔铁（III）离子，这表明形成了铁离子-葡萄糖醛酸复合物。在黄铁矿培养基上生长的细胞的多糖组成不同于前述的多糖，而在硫培养基上生长的细胞显示出相当不同的组成。在后一种情况下，葡萄糖是唯一的单糖，葡萄糖醛酸的含量降低约85％。因此，铁元素也不可检测到。所有胞外聚合物制剂的脂质在其化学成分上没有显著差异，并且由具有12至20个碳原子的当量链长度的饱和长链脂肪酸组成。不同之处在于不产生C₁₃和C₁₅酸。硬脂酸（C₁₈：0）是含量最多的化合物，占总脂质成分重量的约55％。通常可检测到少量的游离脂肪酸，包括棕榈酸（C₁₆：0）和硬脂酸。不饱和脂肪酸是检测不到的。

5 胞外聚合物的功能

表1所示的数据表明，该细菌细胞的胞外聚合物量因底物而不同。用溶解的FeS0₄底物生长的细胞含有的胞外聚合物量最低，而在固体底物（如硫或黄铁矿）上生长的细胞含有中等或高含量的胞外聚合物。显然，细胞根据需要来决定其胞外聚合物的生产量。

第二个发现涉及胞外聚合物对基板类型的适应性。在溶解的FeSO₄的环境下，胞外聚合物中存在各种糖，包括糖醛酸和脂肪酸。对于黄铁矿基质，胞外聚合物的组成变化较小：糖的含量略微减少，而脂肪酸则增加。在两种类型的胞外聚合物中，若与Fe³ 离子的化学计量比为1:2的可检测为糖醛酸。考虑到Fe³ 离子的净电荷为3 ，糖醛酸的羧基电荷为1-，还剩余1 的净正电荷。这种净正电荷使Thiobacillus ferrooxidans的胞外聚合物带正电。因此，在带负电的黄铁矿表面，电池/ 胞外聚合物的吸引力会引起静电相互作用而导致初级附着。（BLAKE ET AL。1994）使用zeta;电位测量发现了类似的结果。这可能解释了为什么这些细菌主要附着在黄铁矿表面存在缺陷的位置上。这些缺陷和附着的细菌如图6原子力显微镜图像所示（Thiobacillus ferrooxidans在黄铁矿上生长4小时后）。

如果Thiobacillus ferrooxidans的菌株R1的细胞与元素硫一起培养，则胞外

聚合物的组成与前一种类型有很大差异。糖的量显著下降。最后，胞外聚合物中

的41％是多糖。此外，各种糖的含量也减少了。只有葡萄糖能被检测到。并且糖醛酸也低于可检测限度。相反，脂肪酸的含量增加，成为胞外聚合物的主要成分。相当明显的是，细胞通过调节糖、糖醛酸和脂肪酸的排泄而适应底物硫的疏水性。糖酸排泄的调节是特别有意义的，因为这些是将细胞附着于例如黄铁矿的物质的先决条件。由于糖醛酸能够络合Fe³ 离子，使附着成为可能，并且开始提出使用这些离子作为氧化剂的降解机理。在存在硫元素的情况下，降解机理不依赖于Fe³ 离子，因此，糖醛酸不排泄也不并入胞外聚合物中。与胞外聚合物的糖组成相反，脂肪酸组成不随底物而改变。只有胞外聚合物中的脂肪酸的量适用于底物，而不是各种酸的组成物。

细胞外脂质组分，特别是部分来自黄铁矿生长细胞的脂质组分可能被认为是表面活性化合物（生物表面活性剂）。 它们可以增加疏水性化合物的溶解度和/或在界面处产生调节膜，或者可以在外膜疏水部分用作胞外聚合物中亲水性化合物的锚定（NEU 1996）。 这种化合物已经在Thiobacillus sp.的表面被检测到。 并且可能参与粘附到疏水性表面过程的初始阶段（JONES AND STARKEY 1961;BEEBE AND UMBREIT 1971;BRYANT ET AL.1984）。

总而言之，Thiobacillus ferrooxidans的细胞根据其底物的疏水性和必要的降

解机制，通过胞外聚合物的化学组成的变化来适应其底物。

如上所述，由糖醛酸络合的Fe³ 离子在黄铁矿和其它金属硫化物的降解中起

关键作用。最近已经显示，Fe³ 离子可以通过氧化溶解黄铁矿。该反应的产物是

Fe² 离子和硫代硫酸盐，其将被peri-和/或细胞质反应连续地氧化（SAND ET AL.1995; SCHIPPERS ET AL.1996）。若非存在含有复合Fe³ 离子的胞外聚合物的活细胞，溶解过程是不能开始的。 如果从细胞中除去这些离子（例如通过离心），即使生长在硫酸亚铁或黄铁矿上的细胞都不能降解黄铁矿（GEHRKE ET AL.1995）。只有在向这些测定实验中提供Fe³ 离子后才能开始溶解。黄铁矿的溶解、代谢活性和Fe³ 离子浓度之间的相关性如图7所示。

死细胞不能氧化黄铁矿，因为开尔文探针的实验被明确证明（GEHRKE ET AL.1998）。如图8所示，在含有胞外聚合物和/或足够量的铁离子的活细菌的情

况下，黄铁矿表面上的腐蚀电位增加。在其他金属硫化物如闪锌矿（ZnS）或高锰酸盐（MnS₂）的情况下，Fe³ 离子能显著提高溶解速率，尽管这些硫化物的主要攻击似乎由质子介导（SCHIPPERS 1998）。因此，溶解机理与上述不同。硫元素代替硫代硫酸盐成为后者硫化合物的主要中间体。

然而，在含有硫

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