1. 研究目的与意义、国内外研究现状（文献综述）

札幌病毒（sapovirus, sav）属杯状病毒科，札幌病毒属，能够引起人类及多种动物的急性胃肠炎。sav基因组为单股正链rna，长度约为7.1-7.7kb，其包含两个开放阅读框（open reading frame, orf），orf1与orf2。orf1编码多聚蛋白，该多聚蛋白由多个非结构蛋白及病毒衣壳蛋白vp1组成，orf2被预测编码一小结构蛋白vp2 [1,2]。由于vp1基因为sav基因组中最高变的区域，且其往往与病毒的一些表型相关，因此该基因被广泛应用于sav的基因分型 [1]。基于全长vp1基因，sav被分为gi到gv 5个基因型，近年来亦有发现gvi到gxiv 9个新基因型，其中在猪群中流行最为广泛的基因型为giii [3-6]。

猪札幌病毒（porcine sapovirus, psav），1979年由美国研究者通过电镜，在27日龄腹泻保育仔猪肠内容物内首次发现，起初命名为猪肠道杯状病毒，后通过进一步研究，于1999年将其归入札幌病毒属 [7,8]。psav的实验性感染证实，其能导致接种后的限菌猪腹泻 [9,10]，部分针对psav的流行病学调查也提示其在猪群腹泻中扮演一定的角色 [11,12]，然而也有研究表明，psav在腹泻猪与无症状猪之间的检出率并无显著差异 [13,14]，提示psav的致病性仍有待进一步明确。目前已在世界各地的猪群中检测发现psav，包括美国、巴西、韩国、日本、西班牙、丹麦等国家 [5,15-18]。psav在我国亦有广泛分布，上海、江苏、安徽、广东、湖南、新疆、贵州等地区均有报道，其rt-pcr检测阳性率在0.9%-14.37%不等 [12,19-23]。

目前针对sav的检测方法，主要包括电镜、elisa、rt-pcr等，前两者由于检测灵敏度较低，实际应用往往较少，而rt-pcr，尤其是qrt-pcr，由于其特异性相对较强，灵敏度相对较高，渐渐成为sav检测的常规方法[1]。目前针对psav尚无灵敏度高、特异性强的常规rt-pcr检测方法，本课题希望针对psav在猪群中最流行的基因型giii，建立rt-pcr检测方法，并应用该方法对猪群粪便样本进行检测，以调查我国猪群中psav giii型的流行情况，同时基于vp1基因对psav giii型进行系统发育分析，以期了解psav giii型在我国猪群中的遗传多样性，为psav的疾病诊断、疫情预警及致病性研究提供参考依据。

2. 研究的基本内容和问题

1 研究目标

构建psav giii型rt-pcr检测方法，并以该方法调查我国猪群中psav giii型的流行情况，同时针对psav阳性样本特定基因进行系统发育分析，以期了解psav giii型在我国猪群中的遗传多样性，为psav的疾病诊断、疫情预警及致病性研究提供参考依据。

2 研究内容

3. 研究的方法与方案

1 研究方法

1.1 引物设计与合成

下载genbank目前已上传的所有psav giii型全基因组序列（截止2018年12月20日），通过mafft（版本7.312）对其进行多重序列比对，随后利用oligo（版本7.0）对psavgiii型基因保守区段设计特异性检测引物，同时于vp1基因两端保守区段设计特异性扩增引物。上述引物均交由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

4. 研究创新点

利用构建的PSaV GIII型RT-PCR检测方法，对来自我国各地区的猪粪便样本进行检测，全面调查了我国猪群PSaV GIII型的流行情况，同时针对PSaV GIII型阳性样本的特定基因，利用特色生物信息学分析技术，进行系统发育分析，有助于了解PSaV GIII型在我国猪群中的遗传多样性，为PSaV的疾病诊断、疫情预警及致病性研究提供参考依据。

5. 研究计划与进展

2018.09-2018.10 psav giii型的rt-pcr检测方法构建

2018.10-2019.12 猪粪便样本处理，利用构建的检测方法调查粪便样本中psav giii型的感染情况