摘 要

在目前的药物领域中，手性胺药物占有者举足轻重的地位，这需要通过ω-转氨酶生物催化方法对底物进行氨化[1]，可以有效地的避免传统化学法的高压高温高能耗高污染，生产手性胺。本课题将利用底物谱对ω-转氨酶进行克隆，将新型ω-转氨酶进行表达，并对其酶学性质进行表征。这种制备ω-转氨酶的方法具有无污染，效率高，经济性强的优势。

本课题通过提取ATA-07的质粒，制备感受态细胞（大肠杆菌E.coli BL21），然后制备我们所需的工程菌，经过一系列的培养后，在不同的实验要求条件下，用IPTG将其诱导表达，用离心机将诱导后的菌种分离出，并用细胞破碎的技术提取表达出的产物，最后利用不同的条件对其进行性质表征，制作出相关图表。

关键词： ω-转氨酶 克隆 性质表征

Cloning expression and characterization of ω-transaminase

Abstract

Chiral amines and non-natural amino acids have great prospects in the drug market. The substrate can be ammoniated using theω-transaminase biocatalysis method, which can effectively avoid the high pressure, high temperature, high energy consumption and high pollution caused by the traditional chemical method and produce chiral amines. In this study, a novel ohm transaminase was cloned using substrate spectrum, and its enzymatic properties were characterized. This method has a lot of advantages for that there is less pollution while with high efficiency and can make more economic benefits.

This topic through the extraction of plasmid ATA-07, preparation of cells (E.coli BL21), and then the preparation we need engineered bacteria, after a series of training, under different experiment conditions, induced with IPTG expression, use after centrifuge will induce strains isolated, and cell crushing technology to extract the expressed product of the last use of different conditions on the properties of the characterization, make relevant charts.

Key words: ω-transaminase; clone; The nature of the representation

目录

摘要 1

Abstract 2

第一章 文献综述 7

1.1 前言 7

1.2ω-转氨酶的优势及实验简介 7

1.3ω-转氨酶的3D结构特征 7

1.4基因克隆 8

1.5本课题的研究目的和意义 8

第二章 实验材料与方法 9

2.1 实验材料 9

2.1.1实验仪器见表2-1 9

2.1.2 实验试剂 9

2.2 相关实验方法 10

2.2.1takata试剂盒 10

2.2.2快速显色法 11

2.2.3HPLC法检测产物含量 12

第三章 实验步骤与数据 12

3.1 ATA-07菌种的构建 12

3.1.1 质粒提取的相关步骤 12

3.1．2感受态细胞的制备 13

3.2探究不同浓度诱导剂对产物的影响 14

3.2．1实验所需器具的灭菌 14

3.2.2 菌种的活化和培养 14

3.2.3转至摇瓶以及不同浓度诱导剂的添加操作 15

3.2.3 不同浓度的诱导过程 16

3.2.4 离心和细胞破碎 16

3.2.5 产物分析操作 17

3.3探究不同诱导时长对产物的影响 17

3.3.1实验方法简介 17

3.3.2 产物活性分析 17

3.4探究不同的诱导温度对产物的影响 17

3.4.1实验方法简介 17

3.4.2产物活性分析 18

3.5探究在最适宜条件下的产物对ph的耐受情况 18

3.5.1实验方法简介 18

3.5.2 产物的最适pH实验操作 18

3.5.3产物活性分析 19

3.6探究在最适宜条件下的产物对金属离子的耐受情况 19

3.6.1实验方法简介 19

3.6.2结果分析操作 19

第四章 实验结果汇报 19

4.1 不同的诱导浓度对产物的影响 19

4.2 不同的诱导时长对产物的影响 19

4.3 不同的诱导温度对产物的影响 20

4.4 不同的pH值对产物的影响 20

4.5不同的金属离子对产物的影响 21

第五章 总结与展望 24

参考文献 25

致谢 26

第一章 文献综述

1.1 前言

手性胺是一种化合物，经常被应用于合成药物，作为一种常见的中间体，它经常出现药物合成以及杀虫剂的合成中，在制药合成领域以及经济领域都有着非常关键的作用和地位[2]。

目前主要有三种方法又来制备手性胺，分别是是化学合成法、生物合成法和生物不对称合成法。而其中的化学法需要用到非常昂贵的辅助溶剂，造成了比较高的经济成本，另外一方面，这种方法在工业上也会产生比较高的污染，不符合现在的环保理念，而且生产纯度较高的生物催化法的最高理论产量也只有百分之五十[3]。

所以我们要选取一种更为可取的方法，通过生物合成法就是一种比较优质的，污染较小却又成本较低的，它的理论产量为百分之一百，这使得它在工业生产部门有很强的应用前景。为了应对甲基苯丙胺的回溯特性，我们需要采取一些策略来使反应的生成方向朝着生成手性胺的方向进行移动，以此来提高它的生产效率[4]。

本课题主要内容为介绍 ω-转氨酶的克隆过程，然后对诱导条件对表达的影响以及不同条件对于产物的影响进行相关的实验与结果分析，并对ω-转氨酶对于未来手性胺药物的应用进行相关展望。

1.2ω-转氨酶的优势及实验简介

手性胺和非天然的氨基酸在药物市场具有很大前景，可利用ω-转氨酶生物催化方法对底物进行氨化，可以有效地的避免传统化学法的高压高温高能耗高污染，生产手性胺。本课题将利用不同的实验条件对ω-转氨酶进行克隆，分别是不同的诱导温度，不同的诱导时间，不同的诱导时长，并对之后表达出的产物进行pH和金属离子的分析[5]。

1.3ω-转氨酶的3D结构特征

ω-转氨酶作为一种重要的生物催化材料，它被归属于PLP依赖型酶，一般来说是通过正丙胺或者是异丁胺作为氨基供体。一般ω-转氨酶分为两种折叠方式。第一种是R型转氨酶，见图1-3（a）中，它属于Ⅳ类折叠，另外一种是属于Ⅰ类折叠，它是S型折叠。因此这两种不同折叠方式的转氨酶有着不一样的空间结构和排列方式[6]。