摘 要

ZnS量子点因具有发射光谱集中且可调、抗光漂白稳定性高、量子产率高等特点而被视为一种极具潜力的荧光探针，目前已有研究将其用于生物分子的标记及荧光成像。然而该量子点在生物体内的药代动力学迄今仍不清楚，本论文初步探索了不同浓度(50，20和5 mg/kg)的ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学及组织分布。首先本研究探明5mg/kg为实验最佳给药剂量。其次，本论文研究了5mg/kg ZnS量子点的血药浓度曲线，发现ZnS药物在雌鼠体内药代动力学过程符合二房室开放模型，药代动力学基本参数血药浓度-时间曲线下面积AUC0-4802.436(mg/Ltimes;h)、峰浓度Cmax4.587（mg/L）、达峰时间Tmax6.000（h）、半衰期T1/269.315（h）、CL 0.027（L/h/kg）。ZnS量子点在雄鼠体内药代动力学过程也符合二房室开放模型，药代动力学基本参数为AUC0-48147.639(mg/Ltimes;h)、Cmax5.621（mg/L）、Tmax1.000（h）、T1/269.315（h）、CL 0.013（L/h/kg）。最后，本研究探索了ZnS在小鼠体内48h的组织分布情况，发现在给药后的2h、6h、12h、24h，48h等时间点内在各组织中药物含量从2h-48h逐渐增高，但是存在一定的性别差异。其中，ZnS量子点在雌鼠体内主要分布在肺、心脏、肝脏和肾脏。在雄鼠中，ZnS量子点则主要分布在心脏、肝脏和肾脏。综上所述，本论文探明ZnS量子点在小鼠体内的主要代谢消除过程药时曲线以及脏器分布情况，对ZnS量子点作为荧光探针辅助医学成像以及重大疾病诊断提供数据支撑。

关键词: 近红外荧光探针；ZnS量子点；药代动力学；血药浓度；药时曲线；组织分布；

Abstract

ZnS quantum dots have been considered as potential fluorescence probes due to their concentrated and adjustable emission spectra, high stability of photobleaching resistance and high quantum yield. At present, they have been used in biomolecules labeling and fluorescence imaging. However, the pharmacokinetics of the quantum dots in vivo is still unclear. In the present study the pharmacokinetics and tissue distribution of ZnS quantum dots with different concentrations (50, 20 and 5 mg/kg) in mice were investigated. Firstly, our study had found that 5mg/kg of ZnS is the best dosage in the current study. Secondly, this study examined the plasma concentration of 5mg/kg ZnS quantum dots at different time points. The drug plasma concentration curve showed that the pharmacokinetics of ZnS in female mice was in accordance with the two-compartment open model. The basic parameters of pharmacokinetics were AUC _0-48102.436 (mg/Ltimes;h). The peak concentration C_max is 4.587 (mg/L) and the peak time T_max is 6.000(h)The half-life T_1/2 is 69.315 (h) the pharmacokinetics of CL 0.027 (L/h/kg). ZnS quantum dots in male mice was also in accordance with the two-compartment open model. The basic parameters of pharmacokinetics are as follows: AUC_0-48147.639 (mg / L times;h), C_max5.621 (mg/L), T_max1.000(h), T_1/269.315(h),CL 0.013(L/kg). Finally, this study explored the tissue distribution of ZnS quantum dots in mice during 48h. It was found that the drug content in each tissue increased gradually from 2h-48h at 2 h, 12 h, 24 h and 48 h after administration, but there were some gender differences. ZnS quantum dots are mainly distributed in lung, heart, liver and kidney in female mice. In male mice, ZnS quantum dots are mainly distributed in the heart, liver, and kidney. In summary, this study explores the plasma time profile curve and organ distribution of ZnS quantum dots in mice. This study would provide supporting data for ZnS quantum dots in potential using as a fluorescence probe in medical imaging and major disease diagnosis.

Keys words: Near infrared fluorescence probe; ZnS quantum dots; pharmacokinetics; blood concentration; drug time curve; tissue distribution.

目 录

第1章 绪论 1

1.1 近红外荧光探针的发展 1

1.2 ZnS量子点的特性以及发展 1

1.3 ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学研究 2

1.4 原子吸收光谱分析法测定ZnS含量 3

1.5 本文研究目的及意义 4

第2章 ZnS实验浓度的确定 5

2.1 实验材料 5

2.1.1 实验动物来源 5

2.1.2 主要试剂和材料 5

2.2 实验操作 6

2.2.1 不同浓度ZnS量子点生理盐水溶液配制 6

2.2.2 给药方式腹腔注射 6

2.2.3 原子吸收光谱法测量ZnS量子点含量 6

2.2.4 正式试验 7

2.3 原子吸收光谱法分析血液和组织中ZnS量子点浓度 7

2.4 结果 9

2.4.1 小鼠一般状态观察结果 9

2.4.2 血药浓度结果及分析 10

第3章 ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学研究 11

3.1 实验动物和药物配制 11

3.2 实验 11

3.3 原子光谱法测量血液中ZnS药物浓度 12

3.4 结果 12

第4章 ZnS量子点在小鼠体内组织分布 14

4.1 实验动物和药品 14

4.2 动物实验 14

4.3 实验结果分析 15

第5章 结果分析 17

致 谢 19

参考文献 20

第1章 绪论

1.1 近红外荧光探针的发展

光学成像技术是目前生物医学研究最重要的成像方式之一，具备许多独特的优点如成像的速度快、灵敏度高、能够进行多通道成像等。其中近红外光学（700-1700nm）成像技术因能有效的降低组织对光的吸收和散射提高荧光成像的组织穿透深度和空间分辨率，已被广泛应用于各种研究^[1]。并且随着纳米技术的不断发展，一系列具有不同组成、不同光学特性和不同功能的近红外荧光纳米探针的发展，极大的提高了荧光成像的组织穿透深度、灵敏度、时空分辨率以及信噪比^[2]。由于近红外荧光在生物体内具备较高的组织渗透率、高的时空分辨率、低背景荧光干扰和低光损伤等特点^[3]，因此发展水溶性与生物相容性良好、量子产率高的长波段近红外荧光探针成为当前研究热点^[4]，并且由于近红外荧光探针因其具有突出的优势信噪比高、组织穿透力强、对基体损伤小而在生物分析领域得到重视^[5]。随着新型荧光材料的持续开发以及化学合成技术的持续进步,近红外荧光探针日益丰富被广泛应用在无损分析、免疫检测和生物造影等方面^[6]。相比于有机近红外荧光染料,无机纳米近红外荧光探针因其摩尔消光吸光系数和荧光量子产率都相对较高、抗光漂白能力强、发射光谱较为集中并且可以调节等优点而备受关注^[7]。

1.2 ZnS量子点的特性以及发展

半导体材料有很多的光特性与电特性，量子点是其中一种三维受限的特殊材料^[8]。量子点是一种三维团簇，由有限数量的原子构成、三维尺寸均在纳米级别^[9]。量子点材料是融合多个学科的材料方面，相比于传统的固体材料量子点具有许多特性使其具有较大的潜在应用价值，因为量子点制备的技术难以提高、量子产率不高、不够稳定，其各方面应用研究并未取得很大进展。随着量子点制备技术的不断提高，量子点开始在生物方面及医学研究中展现出极大的应用前景^[10]。近几年来生物化学、细胞生物学、医学诊断、药物筛选等研究中量子点因其优良的光谱特征以及其光化学稳定性等各种优异特性引起研究者们极大的重视。当前，量子点具有各种不同的应用方向比如在生物体中作为荧光标记物参与体外成像等诊断，追踪某些药物在体内的变化过程亦或是研究患者体内细胞病变状况和组织中的一些异常结构^[11]。

ZnS量子点作为一种半导体材料，因其低毒低污染的特点成为了目前研究的热点材料之一，且ZnS量子点荧光探针具有荧光发射峰可调、高量子产率、荧光寿命长等突出的优点，逐渐成为国内外专家学者们研究近红外荧光探针材料共同选择。例如，南京大学的于俊生教授课题组利用HgS/ZnS等量子点对小鼠体内肿瘤细胞成像，目前恶性肿瘤已成为严重危害人类健康的一类疾病,实现的恶性肿瘤早期精确诊断和及时有效的治疗意义非凡^[12]。荧光成像因其成像速度快、检测非常灵敏、无放射性危害等独特优点适合用于恶性肿瘤的早期诊断^[13]。但是,荧光成像的空间分辨率较低,也无法对深层组织成像,影响了诊断的准确度。近红外量子点因其组织穿透能力强、荧光强度高和稳定性好的特点成为常用的荧光成像探针^[14]。然而,传统近红外量子点含有重金属元素,其潜在的毒性阻碍了了它在生物医学领域广泛的应用^[15]。将ZnS量子点经过修饰之后研发生物安全性可靠、荧光品质出色和胶体稳定性良好的多功能近红外荧光造影剂,对肿瘤的早期诊断和有效治疗有非常深远的意义。天津大学常津教授和国家纳米科学中心梁兴杰研究员的团队发现了ZnS量子点可以光学成像还可能具有部分治疗的功效^[16]。研究中发现ZnS量子单在特定的激光照射下可产生部分光热效应，这种独特的光热效应可以在体内协助恶性肿瘤的治疗，此研究发现ZnS量子点不仅具有优良的光学成像功能还可能在应用于恶性肿瘤一些光热治疗中发挥重要作用^[17]。此外，ZnS量子具有较好稳定性和安全性。综上所述，ZnS量子点不仅具有优良的光学成像应用前景，还可能在重大疾病的治疗中有实际应用价值，是一种非常优良半导体材料。

1.3 ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学研究

目前，近红外荧光探针已广泛应用于各个领域，在生物和医学方面都有巨大的应用前景。但在应用近红外荧光探针参与医学成像等方面时，会默认探针无毒副作用。实际上各种量子点在生物体内并不是无毒的^[18]，已经有研究表明量子点对小鼠的巨噬细胞有一定的影响^[19]，还有部分研究表明量子点主要分布在肝脏，肾脏和皮肤等组织，从而影响人体水盐代谢，尿液产生等^[20]，以及部分研究证实CdS量子点及其偶联物在生物体内也具有一定毒性^[21]。

药代动力学（pharmacokinetics）方面研究是指应用动力学的一些基本原理和数学的处理方法，研究药物通过各种不同的途径（如静脉注射、腹腔注射、静脉滴注和口服等）给药后在体内的吸收（absorption）、分布（distribution）、代谢（metabolism）、排泄（excretion）过程的量变规律，最后将不同部位药物浓度与时间之间的一些关联用数学表达式来表示更加直观且明了药物体内的动态变化^[1]。ZnS量子点作为一种新型的荧光纳米材料，已被应用于生物以及医学基础研究方面．但是目前ZnS量子点在动物模型中的代谢消除过程以及对生物体的毒性还不清楚，妨碍了其在成像及肿瘤诊断和治疗方面的应用，因此研究ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学及组织分布至关重要，在生物体进行药效研究的同时，对其在体内各组织的动态分布蓄积进行观测，系统评价其在代谢过程中会对生物个体以及组织细胞等带来的影响以及其潜在的毒副作用^[22]。

本论文对ZnS量子点在小鼠体内的吸收、分布、代谢进行研究。本实验首先将查阅文献研究不同浓度的ZnS量子点在给药2h内对小鼠状态的影响，同时检测血药浓度及组织分布从而确定最佳给药浓度。其次，本实验对48h内ZnS量子点血药浓度进行检测分析从而确定48h内ZnS量子点在小鼠体内的吸收过程，最后，本实验检测了48h内，ZnS量子点不同的组织中分布情况，从而初步探索其在体内的分布和排泄过程。本实验结果将对ZnS量子点在小鼠体内的生物相容性以及毒性等提供参考数据。

1.4 原子吸收光谱分析法测定ZnS含量

当物质吸收电磁辐射之后，其内部发生量子化能级之间的跃迁。记录由能级所产生的发射、吸收或散射辐射的强度随波长变化会得到的光谱，利用物质特定的光谱对物质进行定性以及定量分析的一种方法就是光谱分析法^[23]。本实验中测定血清和组织中ZnS量子点含量采用原子吸收光谱（Atomic Absorption Spectroscopy，AAS）即原子吸收分光光度法，这种方法主要是利用未激发状态下原子外层的电子相对应原子的共振辐射的吸收强度来测定元素的方法。此方法主要适用样品中微量元素的含量测定^[24]，通过测定样品中ZnS量子点在光谱中对应的波长或其在一定波长范围内的吸光度，对该样品中ZnS量子点进行定量分析。

1.5 本文研究目的及意义

近年来，随着纳米技术的迅速发展,将多种模式诊断制剂和治疗制剂整合为多功能的诊疗制剂已成为新兴生物医学材料的发展潮流。近红外量子点因其组织穿透能力强、荧光强度高和稳定性好等独特优点成为常用的荧光成像探针，其中ZnS量子点因具有突出优势成为极具潜力的荧光探针，目前已有研究将其用于生物分子的标记及荧光成像。但是该量子点在生物体内的药代动力学仍不清楚，本研究通过对ZnS量子点在小鼠体内48小时内血药浓度以及组织分布，初步明确ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学特征以及组织分布特征，对指导其实际应用和安全性评价提供理论基础。综上，通过本项目的研究ZnS量子点在小鼠体内的药代动力学研究对于ZnS作为荧光探针参与医学成像以及应用于重大疾病的早期诊断及有效治疗具有深远意义，为ZnS量子点的进一步应用提供了数据支持。

第2章 ZnS实验浓度的确定

本项目根据查阅相关文献[25]发现ZnS量子点小鼠静脉注射给药2mg/kg、6mg/kg、20mg/kg未出现溶血等明显毒性反应。同时有文献报道，Mn掺杂ZnS给药1mg/kg、5mg/kg未对小鼠造成无明显损伤^[26]。因此，本实验设计了低浓度组5mg/kg、中浓度组20mg/kg、高浓度组50mg/kg三个浓度的实验组。首先，我通过预实验通过设置高浓度（50mg/kg）中浓度（20mg/kg）和低浓度（5mg/kg）三个实验组以及本底对照组，每组四只小鼠雌雄各2只，腹腔注射不同浓度5mg/kg、20mg/kg、50mg/kg的ZnS量子点或者生理盐水100 micro;L后观察精神状态以及行为状态，2h后尾静脉采血100micro;L后脱颈椎安乐死小鼠，解剖后取脑组织、心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和胰腺，观察所有脏器状态，是否有明显炎症反应或者肝脾颜色改变，肿大等明显毒性反应。最后，利用原子光谱法测的血液和组织中ZnS量子点浓度，初步分析后决定后续实验ZnS量子点适宜浓度。

2.1 实验材料

2.1.1 实验动物来源

实验用16只昆明小鼠（KM，25-35g），所有小鼠由湖北省实验动物研究中心提供（No.42000600032936，许可证号SCXK鄂2015-0018），所有小鼠饲养在25plusmn;2℃，12小时光照-黑暗循环下饲养。整个研究过程中，小鼠均可以自由摄取水和食物。

2.1.2 主要试剂和材料

ZnS量子点由武汉理工大学化学化工与生命科学学院孙涛垒课题组高冠斌老师（隶属于材料复合新技术国家重点实验室）提供。抗凝剂肝素钠购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司（产品编号：H104201），现配现用。液氮购自武汉祥云公司，其余实验器材包括手术器械、纱布、注射器、解剖台、移液枪、棉球 、试管、一次性手套及口罩等由武汉理工大学生物技术实验室化生学院孙涛垒课题组分子生物学实验室提供。