1．结合毕业设计（论文）课题情况，根据所查阅的文献资料，每人撰写

2000字左右的文献综述：

文 献 综 述

微生态制剂也称微生态调节剂，主要作用是调整生态失调，保持微生态平衡，提高宿主（人、动植物）健康水平，包括益生菌、益生元、合生元3大类。按菌的种类可分为乳酸菌制剂、芽孢杆菌制剂、酵母菌制剂、光合细菌制剂及复合微生态制剂等。为增进人类健康，益生菌在过去几年里也一直备受关注。应用较多的是乳酸菌制剂类的嗜乳酸杆菌和双歧杆菌^[1]。双歧杆菌是一个常见的益生菌微生物，具有增强免疫和抗肿瘤的效果，以及维持肠道菌群的平衡，并降低胆固醇水平的能力。它们被广泛应用于各种乳制品包括冰淇淋、冰冻的甜点、酸奶、奶酪和酸奶饮品中^[2]。但双歧杆菌属专性厌氧菌，对氧非常敏感，对低pH抵抗力较差，对营养要求苛刻，活性保持较困难。如何最大限度地保持双歧杆菌制品的活性已成为研究热点之一^[3]。

1 真空冷冻干燥保藏法介绍

真空冷冻干燥(lyophilization)保藏法简称冻干法，微生物细胞或孢子与保护剂混合制成悬液，在共溶点以下预冻。然后，在低于三相点压力的高度真空状态下使冰晶升华,最后达到干燥。冻干法由于利用低温、干燥、隔氧的原理保藏菌种,使菌种的代谢终止并处于休眠状态，保藏期得以延长。20世纪 50年代以来，冻干法被广泛应用于微生物菌种的保藏，研究表明:除了某些不产孢子的丝状真菌(如食用菌中的某些担子菌)不宜采用此法保藏外，其它各类微生物采用该法保藏均取得良好效果，菌种保藏期可达10年以上。另外，冻干菌种便于保藏、运输和商品化生产，因而，随着冻干技术和设备的日益完善，冻干法已成为目前世界各国保藏微生物菌种的主要手段^[4]。细胞在冻干过程中要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，损伤是不可避免的。为了提高真空冷冻干燥后微生物的存活率人们进行了大量的研究。影响乳酸菌冻干效果的因素有很多，如菌株、细胞大小及形状、pH值、预冻温度、保护剂系统等，其中保护剂系统的影响最为突出。若在冻干时采取一定的保护措施、加入适宜的保护剂系统，可在很大程度上减轻或避免冷冻干燥对细胞带来的损伤^[5]。

2 常用细胞冻干保护剂的种类

在细胞冻干保存的过程中，需要添加一种或多种膜和蛋白的保护剂，它们大致可分为糖类/多元醇：蔗糖、海藻糖、甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖等；聚合物：羟乙基淀粉(HES)、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇(PEG)、葡聚糖、白蛋白等；无水溶剂：乙烯乙二醇、甘油、二甲基亚砜(DMSO)等；表面活性剂：Tween80等；盐和胺：磷酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐等。

通常使用的冻干保护剂为可溶性物质，因为非还原性双糖能与蛋白质、膜相互作用产生保护效果^[6]。还原糖如乳糖、麦芽糖在贮存期间会通过美拉德反应使蛋白质含量降低，若残留水分较高，这一过程会加速^[7]。因此，选择双糖实际上仅限于非还原性双糖^[8]，如海藻糖。现将具代表性的保护剂的特性和作用情况介绍如下。

2.1海藻糖在细胞冻干保存中的特性

海藻糖是一种在自然界分布广泛的双糖，存在于细菌、真菌、昆虫和植物中。近年来以其抗干燥特性受到了广泛的关注，和其它糖类比较，海藻糖在抗干燥保护方面表现出明显的优势，比如在对生物膜保存的研究中发现，海藻糖无疑优于其它糖。这并非说其它糖类不能保护细胞膜，实际上蔗糖也能起到很好的保护作用，但它需要更高的浓度。在一般的冻干保存中，糖类一般与大分子聚合物共同使用，原因是大分子聚合物对细胞冻存过程中的相变没有影响，但可抑制细胞间的聚集和蛋白的融合，而糖类则可降低熔点值(Tm)。在细胞冻干过程中，对细胞磷脂囊泡的保护有2个必要条件：抑制囊泡间的融合，在干燥情况下降低Tm值。在溶液状态下，此种物质的Tm值为-1e，若在不加海藻糖的条件下干燥，Tm上升到70e，若在干燥过程中有海藻糖的参与，Tm被抑制到-20e，冻干物质可维持在液晶状态并在复水过程中不发生相变。大分子聚合物和糖类这2种物质的联合应用满足了细胞有效冻干的要求。当然，越来越多的研究证明，只有进入到细胞内部，海藻糖在冻干时才能对胞内蛋白和细胞膜起到有效的保护作用^[9]。

2.2盐类在冻干保存中的作用

溶液在结冰时，其中的溶质浓度必然会慢慢增大，那么盐类产生的电解质离子在诱导保护剂的玻璃态转换温度（Tg）中起到什么样的作用呢？Her LM等^[10]对此作了细致的研究，在含有非结晶溶质的冷冻溶液中，加入电解质可明显降低其Tg值，比如在10%的葡聚糖、PVP、乳糖和蔗糖的溶液中加入2%的NaCl可使Tg值下降14-18e。磷酸钠对Tg值的影响较小，当将10%的PVP溶液中加入1%-2%的磷酸钠可以引起在低温热能曲线中的第2个玻璃化，暗示了在冻干液中的相分离。电解质诱导Tg值变化的最可能的机制是它可以增加冻干液中非冰冻水的含量，而这非冰冻水起到了增塑剂的作用，并且降低了Tg值。有些盐类会分离蛋白和PVP联合，在冰晶中把它们分成蛋白富集区和PVP富集相^[2]，这一结果强调了在冻干保护液中减少盐加入量的重要性。

3 双歧杆菌冻干保护剂的研究进展

随着人们对功能性食品的日渐认可，与功能性食品相关的生物菌种也迎来了一股研究热潮，双歧杆菌就是其中一例。但双歧杆菌属专性厌氧菌，对氧非常敏感，对低pH抵抗力较差，对营养要求苛刻，活性保持较困难。如何最大限度地保持双歧杆菌制品的活性则成为研究的热点之一。田洪涛^[2]的《食品微生物学实验教学菌种的保藏》一文则对双歧杆菌的活性保藏给提供了极具建设性的指导方向#8212;#8212;真空冷冻干燥法。但因真空冷冻干燥的条件苛刻，极易对双歧杆菌的生存造成致命伤害，对双歧杆菌的研究方向开始转为冻干保护剂的筛选。张云光^[11]曾在《海藻糖在微生态制剂中的应用》一文中主要介绍了海藻糖对微生态制剂的冻干保护作用及机理，以及在双歧杆菌、乳杆菌等活菌制剂中的技术应用，并对其研究和发展趋势进行了探讨。林云^[12]在对双歧杆菌冻干保护剂条件的研究中，采用了正交实验和单因子实验相结合的方法，对保护剂的种类、配比、与双歧杆菌菌泥的混合条件进行了探讨，最终结果表明：保护剂的最佳组成为5%脱脂奶粉、5%甘油、0.85%NaCl的水溶液，保护剂与菌泥以2：1的比例混合形成pH值为8.5的细胞悬液，平衡60min后再进行冷冻干燥，可明显提高菌体的细胞存活率。纪振杰^[3]在对双歧杆菌冻干保护剂最佳配比的优化实验中，应用单因素试验、析因试验、最速上升试验和响应面分析法，对双歧杆菌冻干保护剂的配比进行了优化，确定冻干保护剂的最佳配方为海藻糖浓度18%、甘油浓度6%、维生素C浓度0.1%、明胶浓度0.1%，以优化的最佳配比进行的3次重复冻干试验，菌体平均存活率可达86.7%。本次实验结合以往文献中出现的方法及材料，最终确定选择脱脂奶、海藻糖等材料，对影响的因素首先进行单因素实验^[13]，其中通过平板划线法^[14]对冻干前后的菌种进行计数，为后期的响应面分析^[15]提供主要的影响因素。

4 本课题研究的目的和意义

本课题通过单因素实验及响应面分析等方法，将确定双歧杆菌在真空冻干干燥过程中所需的冻干保护剂的最佳配比。本课题研究旨在使双歧杆菌避免在冻干过程中，因其特殊的保藏条件对菌种造成的致死伤害，对菌种实施最优的保护，提升菌种在冻干过程中的存活率，并为双歧杆菌的商业应用提供更丰富的技术支持，创造更多的商业价值。

参 考 文 献

[1] 张云光，岳田芳，梁莲华，黄金坚，罗石林. 海藻糖在微生态制剂中的应用[J]. 广西轻工业， 2010， 8（141）：4~6.

[2] Izutsu K，Kojima S. Freeze-concentration separates proteins and polymer excipients into different amorphous phases[J]. Pharm Res， 2000， 17(10)：1316.

[3] 纪振杰，郭德军. 利用响应面法优化双歧杆菌冻干保护剂的配比[J]. 中国生物制品学杂志， 2008， 21(9)：813~816.

[4] 田洪涛，贾英民，张伟等. 食品微生物学实验教学菌种的保藏[J]. 河北农业大学学报：农林教育版， 2003， 5(2)：34~36.

[5] 蒲丽丽，刘宁，张英华，等. 乳酸菌冻干保护剂及保护机理的研究进展[J]. 现代食品科技， 2005， 21(1)：147~149.

[6] Crowe J H，Crowe L M， Carpenter J F et al. Interactions of sugars with membranes[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 1998， 947：367~384.

[7] Bruno F A，Shah N P. Viability of two freeze-dried strains of Bifidobacterium and commercial preparations at various temperatures during prolongedstorage[J]. Food Microbiology and Safety， 2003，68：2336~2339.

[8] 田芬，陈俊亮，霍贵成. 益生菌冻干保护剂优化及菌粉保存稳定性研究[J]. 食品科技， 2012(2)：15~19.

[9] 陈麟凤，刘景汉. 常用细胞冻干保护剂的特性， 作用机制及应用进展[J]. 中国输血杂志， 2006， 19(6)：500~502.

[10] Her LM，Deras M，Nail SL. Electrolyte-induced changes in glass transition temperatures of freeze-concentrated solutes[J]. Pharm Res， 1995， 12(5)：768

[11] 张云光，岳田芳，梁莲华等. 海藻糖在微生态制剂中的应用[J]. 广西轻工业， 2010， (008)： 4-6.

[12] 林云. 双歧杆菌冻干保护剂条件的研究[J]. 饲料研究， 2002， 6：4~7.

[13] 高娟，朱凯悦，武晋先等. 响应面分析法优化草鱼的干腌工艺[J]. 食品工业科技， 2013， 34(006)：246~250.

[14] 刘婷婷，王鲁华，装琳，朱世真. 实时荧光PCR技术快速检验药品中金黄色葡萄球菌[J]. 中国药师， 2013， ：922~923.

[15] 韩德权，杨丽娟，孙庆申，吴桐，孙红书. 响应面法优化植物乳杆菌冻干保护剂[J]. 食品科学， 2010， 31（5）：219~224.