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共价交联的羧甲基壳聚糖的降解及其对于

外周神经再生的潜在应用

Guangyuan Lu, Lijun Kong, Baiyang Sheng, Gan Wang,Yandao Gong,

Xiufang Zhang*

生物科学与技术系，生物膜与膜生物国家重点实验室，清华大学，北京100084

收稿日期：2007年4月21日；修订后接收日期：2007年5月29日；

受理日期：2007年6月7日；上线日期：2007年6月24日

摘要：

由于具有良好的机械性能和生物相容性，壳聚糖在包含外周神经修复在内的各种生物医药领域得到了广泛的应用。然而，壳聚糖本身的降解率很低，并且壳聚糖分子以一种不可控的方式降解，我们猜测可溶于水的交联羧甲基壳聚糖在保留本身良好的机械性能和神经细胞亲和力的同时，会提高其在溶酶菌溶液中的降解速率。在这项研究中，我们通过将壳聚糖链羧甲基化后与1-乙基（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）交联来了解构建模型的性质特征，具体来说，在于(EDC)交联后，壳聚糖的亲水性和弹性系数都下降了，这些变化有利于壳聚糖衍生物在神经修复上的应用，在溶酶菌溶液中经过8周的潜伏，多孔导管的重量减少到之前的30%（PH7.4，37℃），此外，与壳聚糖相比，交联羧甲基壳聚糖可以 加强Neuro-2a细胞的扩散并为Neuro-2a细胞提供一个很好的增殖子层。因此，与EDC交联从而加强壳聚糖衍生物的神经再生作用是一种很有前景的修饰方法。

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关键词:神经组织再生，壳聚糖，羧甲基化，交联，生物相容性

1.绪论

壳聚糖，可以通过甲壳动物中提取的甲壳素部分脱乙酰化而得到，是一个由葡糖胺多糖与N-乙酰胺基葡萄糖通过1-4糖苷键相连的多聚糖，一直以来，在各种生物医学应用方面得到深入研究，如药物和基因载体方面，组织工程支架方面和伤口敷料方面。壳聚糖的一个重要特性就是它能被塑造成多种形式，如薄膜，多孔支架，水凝胶。

壳聚糖良好的生物相容性使其作为细胞移植的载体以生成新的组织，降解性是许多应用材料的重要性质，然而，在这些应用中壳聚糖的降解非常缓慢并且难以控制。作为一个想要通过测定聚合物的降解率来表示新组织的生成氯来说，这是一个重要的限制，羧甲基壳聚糖（羧甲基壳聚糖，一种水溶性的壳聚糖衍生物，也有许多吸引人的物理和生物特性，如凝胶形成能力，低毒性，良好的生物相容性，所有的这些特性使其成为一种有前途的生物材料。

壳聚糖是一种水溶性壳聚糖衍生物，具有凝胶形成能力、低毒性、生物相容性等诸多诱人的物理和生物学特性，使其成为一种极具发展前景的生物材料。它在水中也可被溶菌酶分解，但用于生物医学应用如组织工程支架中的固体羧甲基壳聚糖的降解尚未得到研究， 羧甲基壳聚糖及其活性的进一步研究对这种生物材料的应用来说是必需的。

周围神经缺损的修复是神经外科的一个具有挑战性的任务。一种方法是使用可生物降解的导管来桥接断裂神经末端之间的间隙该导管可以防止神经间隙纤维组织的形成，并引导末端轴突的形成。神经缺损修复完成后，可降解的材料应被身体降解和吸收。这种方法相对于需要进行第二次外科手术来移除植入的导管的自体神经移植或不可吸收的神经修复来说具有明显的优势。许多可可生物降解的生物材料，如胶原蛋白、聚乙醇酸、聚乳酸和L-丙交酯和ε-己内酯共聚物，都已被研究用于神经修复。

在这样的背景下，我们在这里首次报告交联羧甲基壳聚糖在体外的降解及其对周围神经再生的潜在应用。羧甲基壳聚糖是由市售的高分子量壳聚糖经与1-乙基（3-二甲氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）交联之后制备而得到，水不溶性的羧甲基壳聚糖薄膜和多孔神经修复导管即由此得到。通过记录质量随时间的变化来研究羧甲基壳聚糖的降解，最终在对神经Neuro-2a细胞的研究中也用到了这种可降解的羧甲基壳聚糖以推广其在神经修复中的潜在适用性。

2.材料与方法

2.1材料

壳聚糖购自青岛海盛有限公司（中国青岛），用not;1HNMR的方法测得脱乙酰度为93.5%，平均相对分子质量是1.8times;106道尔顿，1-乙基-（3-甲基氨丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、氯乙酸和溶菌酶购自西格玛。培养的基本培养基（DMEM）和胎牛血清（FBS）均购自海克隆。所有其他试剂均为分析纯。

2.2方法

2.2.1羧甲基壳聚糖的制备

羧甲基壳聚糖的制备用的是先前说到的改良的方法，将壳聚糖（10g），氢氧化钠（20g），双蒸馏水（20ml）和异丙醇（80ml）添加到250ml的烧瓶中，在室温下使其溶胀碱化24小时，在羧甲基化之前将烧瓶置于50℃水浴一小时，将氯乙酸（15g）溶于异丙醇（20ml）中，逐滴加入上述反应物中，控制滴加时间为30分钟，在50℃下搅拌反应4小时，然后加入70%乙醇（200ml），停止反应，沉淀过滤，并用70%-90%的乙醇洗涤除去盐、水和异丙醇，真空干燥,所得产物为钠盐形式的羧甲基壳聚糖。

取2g钠盐形式的羧甲基壳聚糖，溶解在100ml水中，均布2小时，然后将溶液置于5000转/分钟的离心机中离心15分钟以除去不溶物，收集上清液，加入400ml乙醇，得到沉淀即纯化后的羧甲基壳聚糖的钠盐。离心收集，此后,羧甲基壳聚糖的钠盐悬浮于80%的乙醇水溶液中（100ml）,加入盐酸（10ml, 70%）混合搅拌30分钟，沉淀，过滤，用70%-90%的乙醇洗涤至中性，真空干燥,即得羧甲基壳聚糖。

2.2.2壳聚糖和交联羧甲基壳聚糖薄膜的制备

将壳聚糖溶于乙酸（1%，v/v）得到壳聚糖溶液（2%，w/v），用中等孔径的尼龙布过滤以除去不溶物，将壳聚糖溶液注入钢模具中，减压除去气泡，保持50℃，直至溶剂被完全蒸发，将薄膜浸泡于2%的NaOH（w/v）溶液中中和30分钟，最后，用蒸馏水洗涤薄膜，风干，干燥后的薄膜厚度为80-110mu;m。

将羧甲基壳聚糖溶于蒸馏水中得到羧甲基壳聚糖溶液，将该溶液注入钢模具中，减压除去气泡，保持50℃，直至溶剂被完全蒸发，在交联之前将薄膜置于丙酮/水溶液中浸泡2小时，然后将其置于50mM（含30mMEDC和6mM的NHS）的的2-吗啉乙磺酸（pH5.5 MES，Fluka公司，布克斯，瑞士）中浸泡0.5小时即完成交联，薄膜表面积与交联剂的体积之比为2.5，最后，用 1mol/L和2mol/L的NaCl溶液交换洗涤（改变6次洗涤液），分别用蒸馏水洗涤，风干，干燥后的薄膜厚度为80-110mu;m。

2.2.3 多孔壳聚糖和交联羧甲基壳聚糖导管的制备

首先制备2%的壳聚糖溶液，按照上面的步骤过滤和除气泡，为了制备导管，将壳聚糖溶液小心地注入真空圆柱形模具中（如图1所示）使用注射器以避免产生气泡，芯轴插入中央腔，并通过基座和中央腔来固定，将该模型置于液氮（-196℃）中彻底冷却，拆除基座和顶部，外结构和芯棒被冻干。将冻干样品浸泡在2%NaOH（w/v）中中和30分钟，然后用蒸馏水洗涤几次置上清液呈中性，后将样品风干。

图1.制备多孔导管模型示意图：1.2.用于固定芯轴的带有中心腔的基座3.外管4.用于盛装聚合物溶液的空心5.芯轴6.气孔

制备壳聚糖溶液，过滤，除气泡，按照上述步骤造型，冷冻，冻干之后即的冰冻干燥的未交联的羧甲基壳聚糖导管，在交联之前将其置于50%（v/v）丙酮水混合液中浸泡两小时，然后置于50mM（含30mMEDC和6mM的NHS）的MES（pH5.5）中浸泡0.5小时，羧甲基壳聚糖的质量与交联剂体积之比为2.5（毫克/毫升），反应四小时后，用浓度为0.1M，pH9.1的Na2HPO4洗涤两次，最后，用 1mol/L和2mol/L的NaCl溶液交换洗涤（改变6次洗涤液），分别用蒸馏水洗涤，风干。

2.2.4 傅里叶变换红外光谱(FT-IR)

用珀金–埃尔默系统2000红外光谱仪（珀金埃尔默，Norwalk，CT）进行红外光谱分析,采集4000–400范围内的谱图。

2.2.5 ¹H核磁共振谱图

用Varian Unity Inova 500NB进行核磁共振实验，用Varian Inc提供VNMR系统来处理所有的数据，羧甲基壳聚糖样品的制备：取适量羧甲基壳聚糖溶于500微升重水配置成浓度为5毫克/毫升的溶液。将样品溶液转移到5mm核磁管中。射频宽度为800赫兹（16ppm），扫描64次，循环延迟1秒，采集时间为2秒，16个数据点，45°脉冲，1H共振频率为500.144836兆赫，所有的核磁共振实验均在室温25℃下进行。

2.2.6 X射线衍射

壳聚糖薄膜的x射线衍射使用x射线衍射仪在30 千伏和30毫安下产生的Ni过滤的 CuKa辐射作为x射线源。干膜切成矩形块(1厘米bull;1厘米), 黏附在基质上进行扫描，以1°/分钟的速率从5°扫描到60°

2.2.7 扫描电镜

在喷射装置中喷上一层金之后，将薄膜与支架置于电子显微镜（KYKY - 2800,设备工厂,中国科学院， 中国北京）下以20千伏的加速电压进行扫描。

2.2.8. 膨胀指数测量

将称取适量干燥的交联羧甲基壳聚糖薄膜(n = 6)和壳聚糖薄膜（n = 6） ，置于磷酸盐生理盐水(PBS,pH值7.4)中浸泡12 小时，用滤纸吸干表面的水分后称重，用以下公式计算薄膜的膨胀指数：

SI=（（WS﹣Wd）/ Wd）times;100%

WS:薄膜的湿重 Wd:表示薄膜的干重。

2.2.9 空气-水接触角分析

用接触角分析仪(承德实验机工厂)分别测量交联羧甲基壳聚糖薄膜和壳聚糖薄膜静态空气-水接触角，测量之前将蒸馏水蒸馏水滴在薄膜表面， 接触角的数据可通过在10秒内所捕获到的水滴的图像而得到。

2.2.10 机械性能测试

用拉伸试验对壳聚糖膜的力学性能进行评估。交联羧甲基壳聚糖薄膜(n = 6)和控制壳聚糖薄膜(n = 6)泡在PBS中浸泡12 h(pH值7.4)后再进行测试，测试样本削成条长度为80毫米的哑铃型条状物。所有样本在室温下以50N的细胞负载使用万能试验机(AG-1,日本岛津公司)进行绘图， 拉伸速度是10毫米/分钟,测量长度是40毫米, 抗拉强度,断裂伸长率和弹性系数均可通过应力-应变曲线得到。

2.2.11 体外降解

用临床上用于神经修复的交联羧甲基壳聚糖的多孔导管来研究EDC交联羧甲基壳聚糖在体内的降解，将交联羧甲基壳聚糖和壳聚糖对照组浸泡在4毫克/毫升的溶酶菌的磷酸缓冲溶液中（pH7.4）温度为37℃。支架的质量与溶酶菌溶液的体积之比为2毫克/毫升，每周换一次溶液，一定时间后将导管从溶酶菌溶液中取出，用蒸馏水洗涤，冻干，称重，降解率用酶解之后的干燥薄膜所占的质量百分数来表示。

2.2.12 细胞培养

分为两个步骤，首先在75%(v / v)乙醇溶液中在孵化30分钟,然后在无菌PBS(pH值7.4)溶液中清洗30分钟，以使薄膜表面无菌。将Neuro-2a细胞播种在交联CM-chitosan薄膜(n = 6)和控制壳聚糖薄膜(n = 6)上，密度为5times;104个细胞/平方厘米。然后将其置于37℃、二氧化碳百分比为5%的环境下进行孵化。薄膜均保持透明，因此可在倒置显微镜下直接观察细胞的形态，使用CCD摄像机便可得到Neuro-2a细胞在薄膜上的随机图像。。经过7天的培养,进行MTT ( 3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐)测试来量化细胞生存能力。在37℃下于MTT中孵化4小时后，,除去MTT溶液，将难溶性晶体溶解在二甲亚砜(DMSO)中。将培养液溶转移到96孔平底板上，测定其在570纳米处的吸光度，吸光度与细胞生存能力成相关。

3.结果

3.1 羧甲基壳聚糖的表征

由于壳聚糖在羧甲基化的过程中为固态,在反应之前需要对其进行溶胀,制备在不同反应温度下的羧甲基壳聚糖样品。 数据未显示在室温下反应的收率非常低，高温可以增加羧甲基壳聚糖的收率。使用不同的溶剂准备羧甲基壳聚糖。结果显示在异丙醇中的收率仅为38.5%,因为在非水溶剂中不完全溶胀和碱化。当水和异丙醇的比例为1:4时，收率达到了90%，这说明了水和异丙醇之比是 壳聚糖羧甲基化的一个重要影响因素。

壳聚糖的红外光谱:未交联的羧甲基壳聚糖和交联羧甲基壳聚糖的红外光谱如图2所示。图2中A表示壳聚糖的基本特征:3456 cm^-1（O-H键出）,2872cm^-1 (C-H键拉伸),1596cm^-1 (N-H键),1152cm^-1 (桥氧键拉伸),和1090cm^-1 (C-O键拉伸)。图2中C上面峰值在1735 cm^-1 (-COOH),1072 - 1139cm^-1 (-C-O),1620 cm^-1和 1512cm^-1 (-NH³ )为羧甲基壳聚糖的特征峰.图 2 B显示羧甲基壳聚糖在钠盐溶液中的红外光谱。羧基变成-COONa吸收峰转移到1598 cm^-1, -NH³ 变成-NH₂ 吸收峰转移到1596

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