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聚乙二醇化壳聚糖衍生物的合成、表征和制药应用

Luca Casettari , Driton Vllasaliu, Enzo Castagnino,

Snjezana Stolnik , Steven Howdle, Lisbeth Illum.

摘要：这次实验提出了描述和讨论了PEG化壳聚糖共聚物的合成方法和应用，尤其是在医疗领域的使用。PEG化脱乙酰壳多糖和脱乙酰壳多糖衍生物是将新的物理化学性质添加到阳离子的多糖聚合物，这种聚合物克服了一些限制，特别是关于它们的溶解度和其在药物和基因递送（DNA和siRNA）方面的使用。实验用不同的方法描述该共聚物的表征，对聚乙二醇化壳聚糖降低壳聚糖的毒性，增强膜渗透性并具有形成热敏性水凝胶的能力也进行了讨论。

关键词：壳聚糖 PEG-G-壳聚糖 聚乙二醇化 药物输送 基因传递 吸收增强

1. 介绍

脱乙酰壳多糖，在过去数十年来已广泛用于在各种应用中，无论是在工业和药学。在制药方面，脱乙酰壳多糖主要作为口腔构成基质系统，用于封装和固定化药物和细胞，粘膜粘附材料和作为粘膜促进吸收。带正电荷的壳聚糖对于相互作用是良好的材料，特别是在超高分子量的化合物中。壳聚糖带有粘液和粘膜表面的相互作用（通过具有带电糖基团如唾液酸），因此已被评价为生物粘附材料，这一方面被用来制备胃滞留的生物黏附微球制剂。一些报告已经将脱乙酰壳多糖作为鼻递送和生物粘附剂。带电壳聚糖和带负电荷的DNA具有之间也具有积极的相互作用，这一特点也已开发用于递送质粒DNA中，的确，壳聚糖纳米颗粒用于基因疫苗一直是特别关注的区域。这次审查将集中在利用壳聚糖和特定聚乙二醇化的脱乙酰壳多糖作为经粘膜吸收增强剂和作为药物和基因递送载体。更具体地说，我们将从它的理化性质出发，讨论通过化学修饰提高其性能，克服目前一些限制的可能性。我们将对聚乙二醇化壳聚糖进行重点讨论，包括制备聚乙二醇壳聚糖的方法，表征，PEG化壳聚糖衍生物的潜在用途、PEG化脱乙酰壳多糖在递送药物、基因和siRNA领域的应用。

1. 壳聚糖理化性质

脱乙酰壳聚糖通常从几丁质产生（第二纤维素后最丰富的多糖物质），通过

脱乙酰碱或酶降解。它的链长度可通过酸水解或酶来控制。脱乙酰壳多糖的糖骨架由-1,4-D-葡糖胺与可变程度的N-乙酰化，与纤维素的结构非常相似，所不同的是在C-2位上的羟基被乙酰氨基（图1）所取代。壳聚糖包括一大群的聚合物，它们的区别在它们的N-脱乙酰化（40-98％）和分子量（50-2000 kDa）。分子量低于50 kDa的壳聚糖一般被称为oligochitosans。壳聚糖具有OH和NH2基，可以产生氢键。此外，壳聚糖的阳离子聚电解质能提供与唾液酸强静电相互作用粘液或带负电荷的上皮组表面。线性壳聚糖分子，表现出足够链柔性，其中主要构象是高度依赖于溶液的离子强度。这些性质被认为壳聚糖有基本的粘膜粘附作用。脱乙酰壳多糖的粘附特性以及增强吸收的性质在之前的文献中已被证明。

壳聚糖是一种典型的具有广泛的氢键多糖。这一特性使得有必要在适当的溶剂体系溶解甲壳素和壳聚糖。市售脱乙酰壳多糖多为游离碱或不同的盐，最常见的这些都是盐酸盐，谷氨酸盐和乳酸盐。由于NH2基的存在，脱乙酰壳多糖在酸性pH下带正电。一个给定的脱乙酰壳多糖的理化性质将取决于产生该壳聚糖的甲壳素的质量和其他不同的产生方式的中间过程（例如纯化，退化和去乙酰化过程）。因此，同类的壳聚糖可能具有不同的物理/化学性质，特别是其在酸性溶液中的溶解度，在增强药物转运跨粘膜的能力方面可能也有所不同。

图1.脱乙酰壳聚糖的化学结构

脱乙酰壳多糖的脱乙酰化程度可以通过三类不同的方法来确定：光谱，常规分析方法和破坏性方法。光谱方法包括：核磁共振（1 H-13C- 15N- NMR），IR光谱，近红外光谱（NIR），UV和一阶导数紫外分光光度法（1DUVS）。常规分析方法包括：电位滴定法，茚三酮测定，凝胶渗透色谱（GPC）和X射线粉末衍射（XRD）。而破坏性的方法包括：元素分析，酶方法，N-乙酰基水解，热分析和热解气体色谱。

图2.脱乙酰壳聚糖在不同ph下的溶解度

已知的确定数均分子量（Mn）和重均分子量来测定脱乙酰壳多糖之比（Mw）是复杂的。准确的测量是其制药应用必不可少的。 Sizeexclusion色谱法（SEC）相对于传统的方法具有快速、可重复性操作的优点，比如静态光散射和渗透压测定法。获得的数据通过SEC，加上多角度激光光散射检测器（SEC-MALLS）表明，该技术是能够提供可靠的分子量和分子量分布的，光散射方法是强烈推荐作为测定壳聚糖分子量的标准方法。

1. 脱乙酰壳聚糖作为吸收增强剂

在研究壳聚糖的生物粘附性工作中得到重要的发现，即该聚合物是不只有生物粘合作用，也有深刻的吸收促进作用。在动物模型中的经鼻给药时的效果高于用高极性分子如肽和共同蛋白（胰岛素，降钙素，黄体生成激素释放激素（LHRH）类似物，生长激素）和吗啡-6-葡糖苷酸。例如，吗啡显示出约70％的生物利用度当结合壳聚糖在经鼻给药羊相比的25％。

Artursson和Dodane研究了壳聚糖对Caco-2细胞单层的效果并发现脱乙酰壳多糖的作用是可逆的，增加了细胞旁磁通的膜 - 透性示踪物，甘露糖醇。利用共聚焦扫描显微镜可视化渗透结。结果表明用壳聚糖处理的上皮细胞（Caco-2）在所表达的部位紧密连接。ZO-1蛋白质的分布的变化应用脱乙酰壳多糖（如溶液或纳米颗粒）也已经由Vllasaliu等报道。 occludin报道的破坏模式Caco-2细胞与脱乙酰壳多糖衍生物的孵化后，脱乙酰壳多糖与细胞的相互作用导致所涉及的细胞激活第二信使和蛋白激酶参与已知生命活动。虽然壳聚糖对紧密连接蛋白的影响在上面所讨论的研究中清楚地表明，但有文章表明壳聚糖诱导磷脂构成膜的双层并提出作为另一种解释细胞上的脱乙酰壳多糖的作用方式。

1. 壳聚糖衍生物

大量的研究旨于通过胺的衍生壳聚糖阳离子和/或羟基基团。相比之下，许多纤维素衍生物以类似的方式被生产。但是，脱乙酰壳多糖与其他多糖（例如纤维素，淀粉，半乳甘露聚糖）相比优点是，它的化学结构允许它更容易在C-2位修饰。

提高水溶性的脱乙酰壳多糖衍生有几种方法。包括磺化，季铵化，羧甲基化，以及N-和O-羟烷基化。此外，各种壳聚糖接枝共聚，例如用乳酸，聚丙烯酸，乙烯基吡咯烷酮，3-O-十二烷基-D-葡萄糖。其中一些衍生物将在下面详细讨论。羧甲基壳聚糖（CMC）是探索最广泛的衍生物（图3）。可以通过氨基和/或羟基基团（N，O，或N，OCMC）来进行羧基化。

图3.羧甲基脱乙酰壳聚糖的化学结构

多种取代度的三甲基壳聚糖和脱乙酰壳多糖的分子量的不同，影响了脱乙酰壳多糖在中性和弱碱性ph的溶解度（图4）。TMC是在水溶性的pH 1.0-9.0 范围内并已被证明即使在分子量大跌幅衍生反应情况下也能对壳聚糖进行测定的一种方法。 TMC已被作为对各种肽的粘膜吸收增强剂和药物分子的基因递送能力进行评价的手段。

图4.三甲基壳聚糖的化学结构

聚乙二醇化壳聚糖（图5）作为脱乙酰壳多糖的衍生物，其优点是水溶性从pH为1.0至11.0，这取决于DS。可用不同的方法接枝，通常在NH2进行。各种报告已经发表了相关的水溶性和生物活性，有证据表明，共轭PEG壳聚糖不仅增强了水溶性和壳聚糖的生物相容性，而且在体内还进一步提升了生物功能性，提高了药物的生物利用度。

聚乙二醇（PEG）是线性的聚醚二醇，这是经常用作非离子型亲水性聚合物。 PEG可以合成各种分子量，一般从0.3 kDa至10.000 kDa，并且可以与不同的终端进行官能端基联合（如氨基，羧基和巯基）。PEG是高度溶于水和在大多数溶剂中溶解包括甲醇，二氯甲烷中。PEG为聚合物或药物衍生的最有利的优点是所得的药物动力学的改善和药效学性质，如长时间身体的停留时间，增加了水溶性，降低肾清除率和有限的毒性。PEG还可以增加酶对药物的稳定性降解（通过蛋白酶或核酸），并减少它的免疫原性。但是，应该指出，尽管PEG是生物相容性的，它不是可生物降解的（以相同的方式如PLGA)。在这个过程中offunctionalizationof壳聚糖，甲氧基的PEG（MPEGS）常用，其中mPEG的游离羟基基团被修饰和活化与氨基适当的反应组成壳聚糖或羟基。活化进行出了许多不同的群体，如醛甲氧基 - 聚（乙二醇） - - 醛），羧（甲氧基 - 聚（乙二醇） - 羧基），环氧化物，甲苯磺酸酯，对硝基苯基碳酸酯，叠氮化物，马来酰亚胺和琥珀酰亚胺酯。

图5. mPEG-G-壳聚糖化学结构

1. 聚乙二醇化壳聚糖的合成方法

壳聚糖每个葡萄糖单元都具有氨基和适合化学修饰的羟基。与C-6和C-3羟基基团相比，在C-2上的氨基具有较高的反应性，这导致具体参与修饰是在大多数化学氨基上。脱乙酰壳多糖的PEG化已使用不同的分子量壳聚糖，并有不同程度的取代。图4显示出的是一个N-二PEG化的脱乙酰壳多糖的化学结构，其中X表示接头的两种聚合物。该连接物X可以由不同的可活化PEG的类型。如前所述，最上发表的PEG化脱乙酰壳多糖的工作报告中，PEG的接枝到组成葡萄糖单元的氨基。然而，我们必须考虑潜在的场景，在某些情况下，其中一个高的DS可能会影响到脱乙酰壳多糖的电荷密度并有可能降低吸收促进效率。即使一些作者建议，PEG onthe OH基接枝可能克服这个问题，使用O型衍生物的壳聚糖是一个可利用选项。合成聚乙二醇化壳聚糖，功能化PEG与合适的端基是根本的重点。合适的方法是对PEG进行化学改性，将反应性PEG接枝到壳聚糖中间体 形成- 羟基PEG，是最有用的最可行的方法。迄今为止，若干PEGchitosan产品已使用化学改性和利用不同的PEG衍生物合成了许多衍生物，如PEG-醛，PEG-羧酸，PEG-碳酸盐，PEG-碘化物，PEGepoxide，PEG-丙烯酸酯，PEG-NHS酯和PEG-磺酸盐。

大多数出版物已经描述了使用甲氧基 - 聚（乙烯乙二醇）（MPEG）代替聚（乙二醇）（PEG），这是为了避免交联脱乙酰壳多糖PEG化聚合物的产生。在这种情况下，mPEG的活性组与氨基的脱乙酰壳多糖反应，反方向的PEG的末端以甲氧基被封锁，不能与其他葡糖胺的另一种胺反应。在一些情况下，反应中会产生PEG-G-壳聚糖，这将阻止常规生产或大规模的合成。

5.1.氨基取代

在众多报道中，Harris是第一个报道采用PEG醛壳聚糖衍生的方法合成PEG-G-壳聚糖衍生物。首先用一个PEG-醛与壳聚糖反应，得到改性亚胺（席夫碱），随后将其通过NaCNBH 3得到PEG-G-壳聚糖（图6）。然而，用于制备PEG-醛的方法有些不方便，这是由于PEG醛的不稳定转化度。有文章报道空气氧化PEG-醛能够容易地发生，从而产生聚合的活化的PEG。Deng等人由oxidationofmPEG（2 kDa的inanhydrous DMSO /醋酐，嫁接到壳聚糖的mPEG-醛（56 kDa的）通过NaCNBH 3，氧化产物随之减少。而本特利和德尔波佐等，合成了不同的分子大小的PEG醛，通过水解，PEG乙醛水合物与脱乙酰壳多糖交联。木内和田沼报道使用二环氧化物的封端的PEG（1，2，4 kDa和2，20 kDa的分别）作为交联剂，这是很容易显示与伯氨基脱乙酰壳多糖的反应（图7）。在这些情况下，烷基化试剂，是一种可与脱乙酰壳多糖结合的化合物，这种方式允许保留净电荷。另一方面，烷基化试剂，如PEG-NHS和PEG-对硝基苯基碳酸酯，与失质子化的中心结合得到非质子化的酰胺或氨基甲酸酯连接基，形成PEG-NHS衍生物，这是脱乙酰壳多糖的PEG化的过程中最广泛使用的，第一步是羧酸活化聚乙二醇，如琥珀酸，戊二酸等。然后将活化的PEG的羧基转化到N-羟基琥珀酰亚胺酯（图8）。活化的PEG接枝到脱乙酰壳多糖的伯氨基上可以在水溶条件下通过使用1-乙基 -3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（EDC）耦合试剂。Saito等用已接枝的mPEG（分子量5 kDa）的壳聚糖（MW70 kDa）与mPEGp硝基苯碳酸酯（图9）与DS78.5％（重量）和92.7％（重量）反应，并测定它的在pH值为7.4以下对的溶解度。 张等用MPEG-对硝基苯基碳酸酯（分子量5 kDa）和胆固醇氯甲酸酯接枝低分子量壳聚糖（19 kDa），形成纳米载体（30〜150纳米和1.1-11.5毫伏）。

图6.PEG-醛衍生化方法

图7.PEG-环氧衍生方法

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