论文总字数：16837字

摘 要

铁皮石斛作为传统的中草药，因为采伐过度，野生铁皮石斛的数量日益减少。研究表明，铁皮石斛体内的内生真菌与其生长有着密不可分的关系。本课题针对铁皮石斛内生真菌的特性展开一系列研究，以期望为进一步了解铁皮石斛与其内生真菌的的共生关系和开展内生真菌促生与诱导天然活性物质提供研究基础。

本课题着重研究了铁皮石斛中的一种内生真菌：SNJ1。首先对该内生真菌进行PDA培养，记录直径、菌落形态，观察其生态学特征；再运用改良CTAB法提取菌株的总DNA；接着，进行内生真菌ITS序列的扩增、测序，通过进化树分析得到其种属关系；然后对SNJ1进行条件优化，从pH、温度、氮源三方面对SNJ1进行培养条件优化。实验中，pH设置6.0、7.0、8.0、9.0四个梯度；温度设置22℃、25℃、28℃、31℃四个梯度；选择蛋白胨、KNO₃、NH₄NO₃三种不同的氮源。

结果表明，SNJ1属于镰刀属真菌，在28℃、pH为7、加蛋白胨的情况下生长状况最好。其中，蛋白胨及KNO₃明显促进了SNJ1的生长。在后期的研究中，还可以着重探讨一下其他变量对SNJ1生长状况的影响，如碳源类别、糖浓度、氮源浓度等。

关键词：铁皮石斛；内生真菌；ITS测序；分子鉴定；条件优化

A Character Study on An Endophytic Fungus of Dendrobium Officinale

Abstract

As a traditional Chinese herbal medicine, wild Dendrobium is gets less with the day due to excessive dredging. Studies have shown that endophytic fungus of Dendrobium officinale have a close relationship to its growth. This topic launches a series of studies for the character of endophytic fungus of D. officinale to look forward to learning more about the relationship between D. officinale and endophytic fungus.And this study can provide research foundation for further growth-promoting endophytic fungus and inducing natural substances.

This paper focuses on the Dendrobium in one endogenous fungus：SNJ1. First of all, this endogenous fungus was observed by PDA culture characteristic and observe its ecological characteristics including the diameter and the lolony morphology. Next use modified CTAB method to extract DNA from this strain. Using analysis of ITS sequence of fungi, we can obtain their species relationship by phylogenetic analysis. Then optimize the conditions of SNJ1, and the optimal culture conditions of SNJ1 were investigated from three aspects of PH, temperature and nitrogen source. In this experiment, we set up four gradients, respectively 6, 7, 8, 9; and four temperature gradient, respectively 22 ℃, 25 ℃, 28 ℃, 31 ℃; Nitrogen set of three controls respectively peptone, potassium nitrate, ammonium nitrate.

The results indicate that SNJ1 belongs to a new strain of Fusarium fungi. Under 28 ℃, pH 7 and plus peptone situation it is in the best growth conditions. The addition of peptone and potassium nitrate promotes the growth of SNJ1. In later studies, we can also explore the impact of other variables focused on SNJ1 growth conditions, such as the carbon source category, sugar concentration and nitrogen concentration.

Key words：Dendrobium officinale; Endogenetic Fungi; ITS; Molecular identification; Optimization

目 录

摘 要 II

ABSTRACT III

目 录 IV

第一章 文献综述 1

1.1 铁皮石斛 1

1.1.1 铁皮石斛概况 1

1.1.2 铁皮石斛化学成分分析 1

1.2 内生真菌 2

1.2.1 内生真菌概况 2

1.2.2 内生真菌的作用 2

1.3 铁皮石斛内生真菌的研究现状 3

1.3.1 早期研究现状 3

1.3.2 国内外铁皮石斛内生真菌研究现状 4

1.4 ITS测序技术 5

1.4.1 石斛物种的传统鉴定技术 5

1.4.2 ITS测序法 5

1.5 小结 6

第二章 铁皮石斛内生真菌的鉴定实验方法 7

2.1 实验材料 7

2.1.1 采样 7

2.1.2 试剂 7

2.1.3 仪器 7

2.1.4 培养基的制备 7

2.2 实验方法 8

2.2.1 内生真菌的形态学鉴定 8

2.2.2 内生真菌的分子生物学鉴定 9

2.2.3内生真菌的条件优化 10

第三章 实验结果与分析 12

3.1 菌株SNJ1的形态学观察 12

3.2 分子生物学鉴定与序列分析 14

3. 2. 1 DNA的提取 14

3. 2. 2 ITS-5.8 S rDNA 的 PCR 扩增 15

3. 2. 3 ITS-5.8S rDNA 的系统进化树分析 16

3.3 培养条件优化 17

第四章 总结与展望 19

4.1 总结 19

4.2 展望 19

参考文献 20

致谢 23

第一章 文献综述

1.1 铁皮石斛

1.1.1 铁皮石斛概况

铁皮石斛是我国一种非常珍稀的兰科药用植物，主要产地是西南和江南各省。现代研究表明，铁皮石斛的主要成分具有抗肿瘤、抗辐射、延缓衰老和增强抵抗力等药理学作用^[1-2]。从中医角度来看，它具有生津止渴、润肺止咳、清热败火的作用。近年来，由于传统中药市场的走俏，铁皮石斛的市场需求量日益增多。过去，铁皮石斛主要取自于野生环境中，但由于自然环境的破坏加重，气候条件的逐渐变化，铁皮石斛的野生产量也愈加减少。同时，以前的铁皮石斛培养主要采取分株繁殖法，繁殖速度较慢，在一定程度上也影响了铁皮石斛的产量。因此，如何提高铁皮石斛的产量是目前扩大其商业价值的最大难题。

1.1.2 铁皮石斛化学成分分析

铁皮石斛体内的化学成分种类丰富，主要包括多糖类、菲类、生物碱类、氨基酸类以及挥发油类等。张红玉等^[3]将S180肉瘤小鼠作为药物模型，通过实验组与正常组结果对照发现，铁皮石斛中的多糖成分具有增强机体免疫力及抗衰老的作用；郑秋平等^[4]通过对铁皮石斛的提取物进行MTT细胞增殖检测分析发现，铁皮石斛体内含有强抗肿瘤活性成分，并且以乙酸乙酯的提取效果最好；吴昊姝等人^[5]以大鼠作为实验模型，采用放射免疫分析和免疫组化HRP-SPR染色等方法研究发现，铁皮石斛可以降低STZ-DM大鼠的血糖值，升高血清胰岛素水平，降低胰高血糖素水平，具有降血糖的作用；鹿伟等人^[6]以小鼠作为实验模型发现，铁皮石斛在抗疲劳方面具有一定的疗效。从目前的研究成果来看，铁皮石斛的药用价值显著。但是，由于铁皮石斛体内的化学成分复杂且单一成分的提取困难，因此部分疗效很难清楚地掌握其药理作用，作用机制尚不明确。这一现状给我国包括铁皮石斛在内的中草药在欧美国家的销售造成了困境。因此，研究者们还需进一步加强对铁皮石斛化学成分的研究及其药理作用的分析。

1.2 内生真菌

1.2.1 内生真菌概况

人们对内生真菌的关注源自于20世纪30年代，由于牧草感染了内生菌的导致大批牲畜中毒^[7]。内生真菌是指在其生活史中的一定阶段或者全部阶段，存在于健康植物的组织或器官中而不引起植物组织或器官出现明显病害症状的真菌^[8]。植物内生真菌具有种类繁多、分布广泛的特点。到目前为止，已经发现了属于双核菌门子囊菌亚门中的核菌纲、盘菌纲和腔菌纲及其无性态的植物内生真菌，还有一小部分其他种类的内生真菌。这些内生真菌主要存在于植物的叶鞘、种子、花、茎、叶片和根等细胞间^[9]。因为内生真菌具有数目庞大、与植物宿主关系多元化，所以内生真菌已经成为了当下研究植物的热点领域。科学家们通过对不同类型、不同种类的内生真菌的研究，对内生真菌的作用已经有了初步的了解。

1.2.2 内生真菌的作用

1. 药用价值

中草药是我国传统文化的瑰宝，也是中药理论研究及发展的基础。中草药种类繁多，对生长环境要求较高。随着气候的变迁，工业用地的不断扩大，适合中草药生长的地区已愈来愈少。而愈加走俏的中草药市场更是令中草药供不应求。因此，是否能找到中草药的等效替代品至关重要。

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